[发明专利]一组胆囊癌血浆外泌体microRNAs标记物及其应用

说明书

本发明提供一组胆囊癌血浆外泌体microRNAs标记物及其检测方法和应用。本组血浆外泌体microRNAs标记物包括在胆囊癌血浆外泌体中升高表达的miR‑552‑3p、miR‑581、miR‑4433a‑3p以及在胆囊癌血浆外泌体中降低表达的miR‑496以及miR‑203b‑3p。利用本发明所述的检测方法可以增强对胆囊癌诊断的特异性和敏感性。本发明所提供的标记物组合、检测方法和试剂盒能够用于辅助胆囊癌的诊断与鉴别诊断、胆囊癌体检筛查、药物治疗疗效评价、复发转移预警、并发症发生、患者预后判断等方面，具有无创、稳定、早期、检测方法简便、检测时间较短等优点，具有较好的临床应用价值。

技术领域

本发明涉及医学分子生物学领域，尤其涉及一组胆囊癌血浆外泌体microRNAs标记物及应用。

背景技术

胆囊癌在胆囊恶性肿瘤中占首位，在胃肠道肿瘤中位居第5位，近年来发病率上升很快，被认为是侵袭性和致死性最高的恶性肿瘤之一。我国胆囊癌相对高发，其日益成为严重威胁广大人民群众生命的恶性疾病。根据全球肿瘤统计(Global Cancer Statistics，2012)，在发达地区，胆囊癌的年龄标准化(ASR，age-standardized rate per 100,000)发病率为2.0，而年龄标准化致死率达到1.4；在不发达地区，年龄标准化发病率为2.4，而年龄标准化致死率高达2.0，这也就意味着，只要发病，患者最终的结局大多都是死亡。胆囊癌常与胆囊良性疾患同时存在，最常见是与胆囊结石及胆囊炎共存，结石的慢性刺激是重要的致病因素。胆囊癌早期无特异的临床症状和体征，大多数患者就诊时已属中晚期，手术切除率低，术后的5年生存率不到5％。综上这些因素，寻找胆囊癌特异性的诊断标志物具有重要的临床意义。

目前，胆囊癌的诊断方法主要包括B超检查、CT扫描、彩色多普勒血流显像等等，但是这些方法的诊断精确度对于胆囊癌诊断尤其是早期诊断来说并不理想。直接取活检或抽取胆汁查找癌细胞也应用于胆囊癌的诊断，但是活检由于其自身的缺陷如不能反映患者整体情况、有加速转移的风险、结果报告滞后以及患者创伤较大等并不适合广泛应用。同时，传统的胆囊癌诊断血清学标志物CA199等的敏感性、特异性很低，不能满足临床需求。近年来，体液活检技术受到临床上越来越多的重视和推广，被“麻省理工大学科技评论”评为“2015十大突破”之一。体液活检是指通过患者的血液或者尿液等对癌症等疾病做出诊断。体液活检的检测内容主要包括血液中游离的循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)、循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)、循环RNA(Circulating RNA)以及近年来的研究热点之一的外泌体(Exosomes)。

外泌体是一种可由机体中的多种细胞分泌的直径为40-100nm的均一、双层膜结构小囊泡，其广泛地分布于细胞间隙、细胞外液，乃至被分泌至唾液、血浆和乳汁等体液中。外泌体是Johnstone RM等在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中发现的，其内容物十分丰富。目前的研究发现，不同的细胞和组织来源的外泌体中确定包含有约9769种蛋白质、3408种mRNA和2838种微小RNA(microRNA)以及1116种脂质等等。与正常细胞比较，大多数类型的肿瘤细胞包括黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和前列腺癌细胞等都可以分泌外泌体，并且其外泌体量更大，内容物差异显著。因此，外泌体被认为可以作为有效的肿瘤诊断标志物。肿瘤外泌体与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，其影响肿瘤的增殖、细胞外基质重塑、侵袭、转移、血管生成、免疫逃逸以及耐药等多个过程。