[发明专利]一种用于基因编辑的核酸构建物

说明书

本发明提供了一种用于基因编辑的核酸构建物，具体地，本发明涉及一种核酸构建物，本发明采用特定结构的核酸构建物，首次在植物中成功实现了sgRNA引导的高效的碱基定点突变(如T突变为C或A突变为G)。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于基因编辑的核酸构建物。

背景技术

植物中许多性状的差异由一个或几个DNA碱基的变异造成，突变某些特定碱基可增强、减弱或抑制其某个性状的表达。CRISPR-Cas9基因编辑技术已经广泛应用于动植物基因编辑的研究中，目前主要包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，碱基编辑器能够在基因组中进行精确的碱基改变(如替换)，且不会造成DNA双链断裂(DSB)。早期开发的CBE和ABE系统，分别由大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1来源于七鳃鳗的胞苷脱氨酶PmCDA1和由tRNA腺嘌呤脱氨酶进化来的TadA组成，已应用于许多植物物种中，如水稻，小麦，玉米，番茄，拟南芥和甘蓝型油菜。为了进一步提高植物的碱基编辑效率，Kang等人对启动子进行了优化，Zong等人对脱氨酶进行了优化。另一方面，为了扩大基因编辑范围，Qin等和Hua等人利用了不同于SpCas9的其它Cas9蛋白，这些Cas9蛋白的变体可识别与经典NGG基序不一样的PAM序列。然而，相对于目前广泛使用的基因敲除技术，单碱基编辑的效率仍然很低。此外，至今报道的碱基编辑器仅能识别有限的几种PAM序列，使得植物基因组中可编辑的范围受到很大的限制。

因此，本领域迫切需要开发一种在植物细胞中可高效、可在较大范围内且精确地实现A-G转化同时显著降低插入或缺失突变风险的新的用于基因编辑的核酸构建物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在植物细胞中可高效、可在较大范围且精确地实现A-G转化同时显著降低插入或缺失突变风险的新的用于基因编辑的核酸构建物。

本发明第一方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：

I1-Z1-Z2-I2 (I)

式中，

I1为第一整合元件；

I2为第二整合元件；

Z1为第一表达盒；

Z2为第二表达盒；

并且，Z1和Z2中的一个表达盒具有Ia结构，而另一个表达盒具有式Ib结构：

P1-S1-X1-L1-X2-L2-X3 (Ia)

P2-Y1 (Ib)；

式中，

P1、S1、X1、L1、X2、L2、X3、P2、Y1分别为用于构成所述构建物的元件；

P1为第一启动子，所述第一启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子；

S1为核定位信号的编码序列；

X1为腺嘌呤脱氨酶(如野生型和/或突变型TadA)的编码序列；

L1为无或第一连接肽的编码序列；

X2为Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；

L2为无或第二连接肽的编码序列；

X3为核定位信号的编码序列；

P2为第二启动子；

Y1为sgRNA的编码序列；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。