[发明专利]一种近红外光控制的动态调控系统及其应用

说明书

本发明公开了一种近红外光控制的动态调控系统及其应用，具体公开了一种近红外光组合控制的涉及动态调控系统及其在乙偶姻生产中的应用，属于代谢工程技术领域。本发明通过分子生物学手段，选择了近红外光光敏蛋白。利用光敏蛋白特异性响应特定波长的光源特性和无需外源添加诱导剂的优势通过在工程大肠杆菌中引入靶向RpoS的动态调控基因线路，实现了在无机盐培养基中生产乙偶姻。通过本发明生产的乙偶姻产量可达66.8g/L，转化率达0.58g/g葡萄糖。

技术领域

本发明涉及一种近红外光控制的动态调控系统及其应用，具体涉及一种近红外光控制的动态调控系统及其在乙偶姻生产中的应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

动态调控系统是代谢工程领域中新兴的代谢流调控手段，其区别于静态调控的主要特征是在发酵过程中，工程菌株会根据发酵时间、生理状态、胞内代谢物浓度、胞外环境变化做出相应的酶活调整，进而影响代谢流分布，提高产品生产能力。动态调控系统具有发酵过程无需人为调控、不需要外源添加诱导剂的优势，在生产高附加值化合物中具有显著优势。

目前的动态调控系统，主要是依靠群体感应系统进行控制的，即系统的触发器是由本源或者异源的群体感应系统组成。当菌体浓度达到一定浓度时，群体感应系统释放积累的小分子物质会作用于调控系统受体，使调控系统做出相应动作。如2017年，ApoorvGupta等人表于Nature biotechnology的动态系统，该系统由EsaI群体感应系统和靶蛋白C末端添加降解标签组合而成，当菌体浓度达到一定阈值时，靶蛋白的被降解，胞内绝对浓度达到0，从而实现酶活关闭，调控代谢流的目的和效果。该系统具有路径独立特征，并成功应用于肌醇、葡萄糖二酸和乙偶姻的生产应用。除此之外，2017年，Xinyuan He等人发表于ACSsynthetic biology的AND逻辑门动态调控系统由群体感应系统和稳定期感应蛋白组成。当菌体浓度达到一定阈值时，启动靶蛋白的转录表达，从而实现代谢流调控目的和效果。该系统运用于PHB生产时，提高了1-2倍PHB产量。综上所述，两种动态调控系统均需要引入异源群体感应系统，然而，异源群体感应系统往往由多个转录调控蛋白组成，它的引入无疑会影响菌株的生长和发酵性能，同时限制了路径酶的表达数量。

乙偶姻是制备香精香料的前体，在大肠杆菌中由丙酮酸路径合成。传统的生产乙偶姻的方法通过过表达路径酶，实现乙偶姻的积累。然而，乙偶姻的生产受到比表面积的限制，引起溶氧传质不均匀的问题，直接影响乙偶姻在大肠杆菌中的生长和积累。因此，提供一种在简单培养基中高产乙偶姻的方法，对于工业制备乙偶姻具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种工程菌株，共同表达近红外光光敏色素、近红外光光响应组分和靶蛋白，所述近红外光光敏色素包括Bphs、Bpho、Yhjh和/或Mrkh；所述近红外光光响应组分包括启动子P_mrkA，所述Bphs的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述Bpho的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述Yhjh的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述Mrkh的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述P_mrkA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述Bphs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述Bpho的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述Yhjh的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述Mrkh的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述靶蛋白为RpoS，所述RpoS的氨基酸序列如SEQID NO.18所示。

在本发明的一种实施方式中，以P_mrkA-RpoS和P_J23119-SO-P_J23119-Y₃₀M-P_J23119-BudAB-NOX为表达载体。