[发明专利]一种肾上皮细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及干细胞生物学领域，具体涉及一种肾上皮细胞及其制备方法和应用。首先公开一种肾上皮细胞，其表达CDH1+和PODXL+，还至少表达CDH2+和LTL+中的一种。第二个方面公开了一种制备肾上皮细胞的方法，包括以下步骤：多能干细胞向后部原条细胞分化、后部原条细胞向后中间中胚层分化、后中间中胚层向肾祖细胞分化、肾祖细胞向肾管状聚集前体分化、肾管状聚集前体向肾泡分化、肾泡向肾上皮细胞分化。本发明提供的制备方法分化效率高、分化效果稳定，适用于多种hPSC细胞株。分化得到的肾元祖细胞可以满足肾疾病模型建立、肾脏药物毒性的测试以及与肾脏疾病相关的药物筛选等科研实验需求。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学领域，具体涉及一种肾上皮细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肾脏是人体内重要的器官，具有复杂的空间结构。作为泌尿系统的组成部分，肾脏的主要功能是调节体液的成分和体积，并清除代谢废物。成熟的肾脏会通过肾元对血液进行过滤并多次回收人体内需要的物质而最终产生尿液排出体外。此外肾脏还具有调节血压，维持体内酸碱平衡等功能。

将人多能干细胞(hPSC，包括人胚胎干细胞hESC和人诱导多能干细胞hiPSC)分化为肾祖细胞和肾脏类器官为研究人类肾脏发育、遗传性肾脏疾病、肾损伤、肾毒性测试以及肾脏再生等方向提供了一个新的体外研究平台。当前输尿管芽细胞及后肾间充质细胞的发育过程已经逐步明确，但肾脏组织中的其他类型细胞如内皮细胞和间质细胞的发育过程尚不清楚。通过研究hPSC向肾脏类器官的体外分化过程，可以帮助我们进一步加深对体内肾脏发育的了解。同时可通过各分化阶段的细胞来研究先天性肾脏异常，以及肾毒性药物的筛选。目前已有160多种具有明确突变的遗传性肾脏疾病。通过遗传性肾病患者的iPSC分化得到肾脏类器官，可以构建肾疾病模型，探究遗传性肾病的发病机制。结合CRISPR/Cas9基因编辑技术对iPSC引入目标突变，可以在保证其他遗传背景一致的情况下对突变型和亲本细胞株分化而来的类器官进行比较。肾元的逐渐损失，是导致慢性肾脏疾病(CKD)的发病一个重要原因。目前该病晚期的治疗手段主要为透析和肾脏移植。只在胚胎发育期，肾脏才会不断形成新的肾元，新生儿出生后肾脏的肾元数目不再增加。由患者来源的iPSC分化产生高质量无污染的肾元祖细胞并通过体外扩大培养或许可以作为免疫兼容的组织，使CKD病人能够再次产生新的肾元，从而达到对CKD的治疗效果。

与本发明最接近的文章有：Taguchi等报道了相对高效的60％左右的后肾间充质细胞(SIX2+细胞)的诱导效率，这些诱导出的后肾间充质细胞进一步分化为肾元结构。然而他们只得到后肾间充质细胞类型，没有收集管、肾间质和内皮细胞类型。Takasato等分化出的肾脏类器官不仅包括收集管和肾元也包括肾间质细胞和内皮细胞网络，但中间中胚层向肾脏类器官分化这一过程并不完全明晰，使用高剂量的FGF9进行分化诱导的成本也太过高昂，并且对于疾病模型的构建也未提及。Morizane等提出的分化方案成功获得90％左右SIX2+细胞，并进一步采取2D和3D两种培养方式分化出具有各段肾小管(包括近端小管、亨利氏环、远端小管)和肾小球足细胞的肾元结构并且能够对肾毒性药物作出应答，引起细胞凋亡。对于输尿管芽细胞，间质细胞及内皮细胞等肾脏中的其他细胞类型，该方案没有提及。

与本发明最接近的专利有：Method of differentiation of pluripotent stemcell for forming kidney organoids。该专利说明了一种将hPSC分化为血管化的肾脏类器官，该方案使用Wnt激动剂，FGF信号激活剂，肝素，视黄酸，RA拮抗剂等多种试剂诱导分化，成本过于高昂。

目前现有的各肾上皮细胞分化方案在分化方案在过程和原理上均有所不同，这些分化方案具有以下缺点：1)分化成本过高，分化周期长；2)培养基成分复杂来源不明确；3)分化效率低无法得到更多的肾上皮细胞。

发明内容