[发明专利]一种分离绵羊肺炎支原体的方法

说明书

本发明提供一种分离绵羊肺炎支原体的方法，包括以下步骤：(1)采集样品及样品处理，得到样品接种液；(2)鸡胚接种；(3)绵羊肺炎支原体的分离：收集接种后死亡鸡胚和/或9d后未死亡鸡胚，取鸡胚尿囊液进行绵羊肺炎支原体进行活菌检测，若收集鸡胚尿囊液绵羊肺炎支原体阳性，进行保存；若第1代鸡胚尿囊液均为阴性，则将收集鸡胚尿囊液盲传鸡胚，方法同上，若盲传3代仍为阴性，则判定样品为绵羊肺炎支原体阴性，弃去。本发明的方法操作简单，不需要配制成分复杂的绵羊肺炎支原体培养基，避免了现有技术分离培养基配制中常需要高压灭菌或配备大容量滤器等问题；本发明方法可获得不含动物血清的绵羊肺炎支原体。

技术领域

本发明属于兽医生物技术研究技术领域，具体涉及一种分离绵羊肺炎支原体的方法。

背景技术

绵羊肺炎支原体是一种可引起羊呼吸系统疾病的微生物。绵羊肺炎支原体既可感染绵羊，也可感染山羊。健康羊鼻腔也可分离出该病原。该病原呈全球性分布。该病原目前在我国流行，给养羊业带来严重威胁。

绵羊肺炎支原体比较娇嫩，分离及培养需要特殊的培养基。改良Thiaucourt's培养基是一种常用的绵羊肺炎支原体分离培养基，培养绵羊肺炎支原体效果较其他培养基如改良KM2培养基等培养滴度高，效果较好。现有技术绵羊肺炎支原体培养基成分复杂，除含有碳源、氮源、蛋白质、无机盐等诸多营养组分外一般还需要添加10％～20％不等的动物血清。现有技术培养基配制步骤繁琐，常需要准备多达8～9种试剂，此外常需要配制新鲜酵母浸出液、1％NaOH、1％的酚红等试剂，配制培养基须经灭菌或滤膜滤过除菌等步骤。现有技术培养绵羊肺炎支原体仍存在繁殖能力差等问题。此外，现有技术培养基中使用血清存在诸多问题，如血清批次差异容易导致培养基批间差异较大、成本高、生物安全、易增加免疫副反应等问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种分离绵羊肺炎支原体的方法。

本发明提供一种分离绵羊肺炎支原体的方法，包括以下步骤：

(1)采集样品及样品处理，得到样品接种液；

(2)鸡胚接种：将步骤(1)得到的样品接种液接种7-8日龄健康SPF鸡胚，接种后，将鸡胚置于孵化箱中继续培养；

(3)绵羊肺炎支原体的分离：收集接种后死亡鸡胚和/或9d后未死亡鸡胚，取鸡胚尿囊液进行绵羊肺炎支原体进行活菌检测，若收集鸡胚尿囊液绵羊肺炎支原体阳性，进行保存；若第1代鸡胚尿囊液均为阴性，则将收集鸡胚尿囊液盲传鸡胚，方法同上，若盲传3代仍为阴性，则判定样品为绵羊肺炎支原体阴性，弃去。

作为优选，步骤(1)中，所述采集样品及样品处理的具体方法为：无菌棉签采集羊鼻拭子；鼻拭子样品中加入灭菌的0.01M pH7.2 PBS，用振荡器充分振荡，将棉签挤压干净，弃去棉签，用灭菌的0.01M pH7.2 PBS补足；取上述样品处理液经滤膜孔径为0.45μm的无菌滤器过滤除菌，取1.0ml滤过液，加入青霉素，置4℃作用12～18小时，得到样品接种液。

作为优选，步骤(2)中，所述接种的方法为鸡胚卵黄囊接种，接种量为每枚0.2ml。

作为优选，步骤(2)中，所述孵化箱中培养的温度为37.0～37.5℃，湿度为50％。

本发明还提供上述的一种分离绵羊肺炎支原体的方法在绵羊肺炎支原体分离中的应用。

与现有技术相比，本发明的方法操作简单，不需要配制成分复杂的绵羊肺炎支原体培养基，避免了现有技术分离培养基配制中常需要高压灭菌或配备大容量滤器等问题；本发明方法可获得不含动物血清的绵羊肺炎支原体。此外，该方法SPF鸡胚清洁程度高，无菌，易获得、成本较低、分离率高等优点。因此，本发明方法可用于绵羊肺炎支原体的分离培养，也可用于绵羊肺炎支原体抗原的增殖生产。

附图说明