[发明专利]一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置及其制样方法

说明书

本发明公开了一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置和制备方法，包括：具有制样操作状态和冷冻操作状态的支持网组件；分别进行取样操作以及在所述支撑网组件上对待检测样品溶液完成制样操作的制样探针；驱动制样探针在取样操作和制样操作之间转换的三维平移台；对支撑网组件上样品溶液进行冷冻操作的冷冻模块；驱动支持网组件在制样操作状态与冷冻操作状态之间进行转移的快速转移装置。本发明可实现具有超微量样品消耗的冷冻电镜样品制备实验，单个样品液滴的消耗量在纳升级及纳升级以下。样品消耗量较常规制样机器人减少了1000倍以上，显著降低了实验成本，缩短了蛋白质样品纯化周期。显著提高冷冻电镜制样的成功率和实验的重现性。

技术领域

本发明所涉及的领域为微流控、自动化和冷冻电镜领域，特别是涉及一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置及其制样方法。

背景技术

冷冻电镜技术是当前生物大分子物质结构解析的主流技术，它通过拍摄镶嵌在铜网碳膜孔的无定型冰中的生物大分子颗粒照片，然后通过三维重构技术解析得到生物大分子的精细三维结构。用冷冻电镜技术解析蛋白质等生物大分子三维结构的主要流程包括：冷冻电镜样品制备、图像采集、数据处理和三维重构。冷冻电镜样品制备是冷冻电镜实验的第一步，其目的是将待分析的样品溶液铺展在铜网上，使样品溶液在铜网表面的碳膜上形成数十至数百纳米厚的液层，然后将铜网快速投入液态乙烷中冷冻，使样品由液态转变为冷冻电镜观测所需的玻璃态。除了生物样品本身的性质外，铜网碳膜孔中的无定型冰厚度是决定冷冻电镜能否采集到高清晰生物大分子颗粒的关键因素。此外对于一些珍贵的生物样品，其在制样实验中的样品消耗量也是必须要考虑的因素，样品消耗量越少意味着实验成本越低、实验效率越高。因此理想的冷冻电镜制样方法需要具备样品冰层厚度可控、样品消耗量小的特点。

冷冻电镜样品制备的常规方法为用商品化机器人进行制样。FEI公司的Vitrobot系统是当前主流的冷冻电镜制样机器人，被各大冷冻电镜中心广泛采用。但Vitrobot系统需人手工将4μL以上样品通过移液枪注射到固定在机器制样室中的铜网表面，然后Vitrobot系统制样室内的两片环形滤纸会被按压在铜网表面，吸走近99％的样品，以制备得到纳米级厚度的样品液层，最后仪器会将铜网插入液态乙烷中完成冷冻电镜样品制备实验。目前商品机器人用于冷冻电镜制样的主要缺点为样品消耗量较大(绝大部分样品被滤纸吸走)、铜网碳膜上的样品冰层厚度不可控、实验成功率低和重现性差。

除商品机器人外，也有少量文献报道了一些研究组自制的冷冻电镜制样装置，这些装置主要分为基于压电喷墨原理的冷冻电镜制样装置和基于气体喷射的微流控芯片。基于压电喷墨原理的冷冻电镜制样装置利用压电喷头将样品喷射到铜网表面，然后将铜网插入液态乙烷中快速冷冻完成制样。这类系统的局限性是其喷头的死体积较大(30μL)，单次实验耗费的样品体积远超常规的制样机器人，样品液滴喷射在铜网的单一区域，对铜网的利用率不高，且仪器运行速度慢，铜网上的样品在插入液态乙烷的过程中容易变干。基于气体喷射的微流控芯片也已被应用到冷冻电镜制样中，其原理为在微流控芯片中加工微通道和喷嘴，将样品和高压气体(通常为氮气)持续通入芯片并在通道中混合，样品在高压气体的带动下从喷嘴出喷出，喷射在铜网表面，然后完成样品冷冻。微流控芯片用于冷冻电镜样品制备的主要缺点是连续喷射的样品流会消耗大量样品，体积在数十微升，对喷射到上的样品的体积可控性差，且高压气体会使铜网表面的碳膜破裂。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有纳升(10^-9升)及纳升以下样品消耗量，且样品冰层厚度可控的冷冻电镜样品制备装置。

为实现上述发明目的，可以采用如下技术方案：

一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置，包括：

具有制样操作状态和冷冻操作状态的支持网组件；

分别进行取样操作以及在所述支撑网组件上对待检测样品溶液完成制样操作的制样探针；

驱动制样探针在取样操作和制样操作之间转换的三维平移台；