[发明专利]检测CAH相关真假基因的方法

说明书

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测CAH相关真假基因的方法。具体的，本发明公开了一种确定CAH相关基因的突变情况的检测方法，其中CAH相关基因包括：CYP21A2基因和CYP11B1基因，所述方法包括以下步骤：S1：提取样品中DNA并使用引物组进行PCR扩增；S2：用三代测序平台对扩增产物进行检测；S3：对测序结果进行分析得到CAH相关基因的突变情况。本发明公开的方法通过设计引物组将真假基因一起扩出，通过长片段建库测序可检测出突变类型。该方法可以同时检测到已知的CYP21A2和CYP11B1基因致病突变，且灵敏度高，只需样品中含有1‑50ngDNA即可；操作方便；可以检测到长片段的缺失，区分真假基因，同时可检测到未知的染色体结构变异。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测CAH相关真假基因的方法。

背景技术

人类基因组大约有2.91G个碱基，在两万多个基因中有一些特别的基因。这些基因有非常相似的假基因，给现有的检测方法带来了很大的困扰。由于真假基因的相似性，在人类细胞减数分裂时染色体联会期间可能出现错误的重组，产生真假基因的融合，因此产生新的突变导致真基因的表达功能丧失或不全。

先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一种由于肾上腺皮质激素合成过程中酶的缺陷所引起的疾病，属常染色体隐性遗传病，引起男性化者又称肾上腺性征异常综合征。典型的CAH发病率约为1/10000，而非典型的发病率约为典型的10倍，并有种族特异性。21-羟化酶缺乏症(ZD-OHD)是先天性肾上腺皮质增生症中最常见的一种，占典型病例的90％-95％，CAH会导致低血钠及高血钾、严重者可导致休克，对于新生儿来讲未出现症状时做出尽早的诊断，可有效地减少肾上腺危症的发病率及病死率，这是至关重要的。

超过90％的CAH由CYP21A2基因突变导致，CYP21A2(Gene ID:1589)位于染色体6p21.3，全长3.5kb，在距其30kb处有一个高度同源的假基因CYP21A1P(Gene ID:1590)，外显子同源性达98％，内含子同源性达96％。假基因与CYP21A2的主要区别为外显子3中8bp的缺失，外显子7中1bp的插入，及外显子8发生的C到T的点突变形成终止密码子，这些变异导致假基因没有功能。该基因突变致使21-羟化酶部分或完全缺乏，由于皮质醇合成分泌不足，雄激素合成过多，致使临床出现轻重不等的症状。可表现为单纯男性化典型、失盐型和非典型三种类型。

CYP21A2与CYP21A1P排列位置相近且同源度很高，因此90％～95％的21羟化酶等位基因突变与真假基因在细胞减数分裂期间出现同源重组偏差或者连锁不平衡所致的真假基因错配有关；包括真基因大片段缺失和真假基因间碱基互相转换两种，其中c.293-13CG和真假基因融合为最常见2种突变类型，分别占34.2％和18.4％(参考文献：《The next150 years of congenital adrenal hyperplasia》)，CYP21A2的突变70％-80％来源于CYP21A2与CYP21A1P的碱基互换，因而真假基因辨别显得尤为重要。

11β-羟化酶缺陷症(11β-OHD)约占CAH的5％-8％，CYP11B1是11β-羟化酶的编码基因，CYP11B1存在假基因CYP11B2。此酶缺乏时，雄激素和11-脱氧皮质酮均增多，临床表现出与21-羟化酶缺乏相似的男性化症状，但程度较轻。

现有的基因测序主要包括以下几种：

(一)一代测序，即设计很多对引物，通过普通PCR扩增，一代测序后再进行全长拼接。其具有以下缺陷：

1、读长短一般为500-800bp，遇到poly结构测序质量不好，不能准确判读；

2、需要设计7对左右引物，工作量大，操作繁琐；

3、低剂量基因组不能很好检测全长，需要一个样本很大量DNA才能拼接到全长；

4、一代测序读长较短，不能很好区分真假基因，假基因会影响真基因突变的判读；