[发明专利]冰草叶来源无菌材料的保存和复苏方法

说明书

本发明公开了一种冰草叶来源无菌材料的保存和复苏方法，包括以下步骤：S1：冰草叶预处理后接种于诱导培养基上，培养10‑15d形成愈伤组织；S2：形成愈伤组织后，转接至继代培养基上，分别置于常温、4℃冷藏、或按慢冻方法置于‑20℃低温或‑80℃超低温冷冻条件下进行保存；S3：在不同温度下保存的愈伤组织分别转移到不同的复苏继代培养基上生长，正常温度下培养。本发明的方法经常温、低温或超低温保存的愈伤组织，可以延长保存时间，减少继代培养，相比常规定期继代培养大大减少工作量，还能保证愈伤组织正常恢复生长。

技术领域

本发明涉及植物组织培养和种植资源保存技术领域，特别涉及一种冰草叶来源无菌材料的保存和复苏方法。

背景技术

冰草(拉丁文名：Agropyron cristatum(L.)Gaertn.(Gramineae).)别名：多花冰草、光穗冰草，禾本科、冰草属多年生旱生禾草，秆成疏丛，适应半潮湿到干旱的气候。天然生冰草很少形成单纯的植被，常与其它禾本科草、苔草、非禾本科植物以及灌木混生。生于干燥草地、山坡、丘陵以及沙地，为优良牧草，青鲜时马和羊最喜食，牛与骆驼亦喜食，营养价值很好，是中等催肥饲料。冰草中还富含天然植物类黄酮化合物，氨基酸等，还含有低钠盐，对人的健康也有益。由于品质好，营养丰富，适口性好，人和家畜均喜食；又因返青早，同时能较早地为放牧家畜提供青饲料。但是由于各种因素，现有天然的冰草在逐渐减少，而由于冰草营养价值高、适宜食用及做饲料等优势，近些年，人们开始研究冰草外植体的组织培养，以不受环境条件影响，在任何时候都能为人工种植提供优良的培养苗。

植物组织培养是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下，培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。愈伤组织是植物组织培养中关键的材料，可以用它来进行愈伤组织的扩增培养、分化芽或根来大量繁殖植物体；也可作为单细胞的来源，进行细胞的悬浮培养。愈伤组织的常规保存方法是定期继代，但工作量大，而且继代次数过多也会导致材料的倍性变化，因此，寻求适当的保存方法对于科研和教学有积极的作用，同时对于随时进行人工种植提供优良的种苗提供便利条件。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种冰草叶来源无菌材料的保存和复苏方法，该方法以冰草叶的愈伤组织为材料，通过愈伤组织在不同培养基下的诱导和不同温度下保存，获得能复苏且正常恢复生长的愈伤组织，该方法保存的愈伤组织时间长、继代次数少。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种延长冰草叶来源无菌材料保存和复苏的方法，包括以下步骤：

S1：预处理后的冰叶草，切成小段，接种于诱导培养基上，培养10-15d诱导形成愈伤组织；培养条件：温度25-27℃、光照1200-1500Lux；

S2：形成愈伤组织后，转接至继代培养基上，分别至于常温、4℃低温冷藏、-20℃低温或-80℃超低温冷冻条件下进行保存；

不同温度下保存的继代培养基，包含以下成分：MS培养基1L、NAA 0.5-1mg、2,4-D0.3-0.5mg、蔗糖30-35g、甘露醇10-30g、脱落酸25-50μmol，其中，常温保存和低温保存时在所述继代培养基的基础上添加琼脂6.5-7.5g；

S3：在不同温度下保存的愈伤组织分别转移到不同的复苏继代培养基上生长，正常温度下培养。

优选的是，S1中所述冰草叶的选择条件：选取生长健壮、无病虫害幼嫩冰草叶。

优选的是，S1中所述预处理为：将选取冰草叶洗净后，用质量分数为75％酒精溶液浸泡30-40s，再用质量浓度为0.1％-0.2％升汞溶液浸泡10-15min，之后用无菌水冲洗4-6次，置于无菌纸上吸取水分。

优选的是，S1中预处理后的冰草叶，切成1-1.5cm小段；每个50mL试管中接种2-3个小段的冰草叶。