[发明专利]一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法

说明书

本发明公开了一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法。本发明首先提供一种表面螯合金属离子的磁性纳米材料：在氧化石墨烯的表面修饰磁性纳米颗粒，得到产物1；在产物1的表面包覆二氧化硅层，得到产物2；在产物2的二氧化硅层表面修饰带有氨基的硅烷偶联剂，得到产物3；在产物3的表面修饰金属螯合剂，得到产物4；在产物4的表面螯合金属离子即得。本发明磁性纳米材料可用于提取尿液中外泌体，并用于外泌体中蛋白质或磷酸化蛋白质组学分析。通过利用外泌体膜磷脂双分子层表面裸露的磷酸根与金属离子之间通过双配位的化学作用结合，同时结合静电吸附的作用，实现对尿液外泌体的高特异性提取，提取速度快，回收率高。

技术领域

本发明涉及一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法，涉及生物技术及分析化学领域。

背景技术

磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，磷酸化蛋白参与了许多重要的生理过程，如细胞凋亡、细胞增殖和细胞迁移等。肽段的磷酸化水平的变化与许多疾病的发生发展密切相关，具有作为疾病生物标志物的潜在应用前景。然而，由于蛋白质磷酸化状态不稳定，并且体液中存在高丰度的磷酸酶，给磷酸化蛋白质及磷酸化肽段的检测带来极大的困难，从而限制了磷酸化蛋白在疾病早期诊断中的应用。外泌体是由细胞分泌的一种具有完整膜结构、粒径约30～150nm的微囊泡，携带有蛋白质、DNA、RNA和脂质等。在完整囊泡结构的保护作用下，外泌体携带的生物分子可以避免直接与体液中各种酶接触，从而可以稳定的存在于外泌体中。尿液作为一种重要的体液，不仅具有取样容易、无创性等优点，而且研究发现，尿液中含有大量的外泌体，因此，对疾病相关的尿液外泌体的磷酸化蛋白质分析在早期诊断中有重要应用价值。

在进行尿液中外泌体磷酸化蛋白质分析前，首先需要从尿液中提取外泌体。目前常用的外泌体提取方法有超速离心法、沉淀试剂盒法、免疫亲合法和微流控芯片法等，这些方法存在提取时间长、步骤繁琐、提取效率低等不足。因此，开发快速、高效、高特异性的外泌体提取方法是尿液外泌体磷酸化蛋白质研究的首要任务。此外，外泌体中磷酸化蛋白的丰度相对较低，进行质谱分析时，磷酸化肽段信号容易受到大量非磷酸化肽段的干扰和抑制，在进行尿液外泌体磷酸化蛋白质分析时，还需要对磷酸肽进行选择性富集。

发明内容

本发明的目的是提供一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法，通过本发明方法能够从尿液中提取外泌体，并且对其中的磷酸化蛋白/肽段进行选择性的分离富集。

本发明首先提供一种表面螯合金属离子的磁性纳米材料，其按照包括如下步骤的的方法制备：

1)在氧化石墨烯的表面修饰磁性纳米颗粒，得到产物1；

2)在所述产物1的表面包覆二氧化硅层，得到产物2；

3)在所述产物2的二氧化硅层表面修饰带有氨基的硅烷偶联剂，得到表面修饰有氨基的产物3；

4)在所述产物3的表面修饰金属螯合剂，得到产物4；

5)在所述产物4的表面螯合金属离子，即得到所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料。

上述的制备方法中，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒(直径为20～200nm)；

所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷；

所述金属螯合剂为琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA-NHS-ester)，其一端可与氨基结合，另一端可螯合金属离子；

所述金属离子为Ti⁴⁺、Zr⁴⁺或Sn⁴⁺，能与磷酸根基团发生双配位作用。