[发明专利]基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法

说明书

本发明公开基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，将目标基因分别构建到表达载体的N端，提质粒后转化农杆菌，制备农杆菌侵染液共注射模式植物，提取共注射烟草叶片蛋白，用GFP‑Trap A beads去富集带有GFP标签的目标蛋白，同时将带有mCherry标签的其他目标蛋白免疫下来，最后分别使用GFP和mCherry标签抗体检测目标蛋白在免疫前和免疫后的表达及互作情况。本发明在实现荧光可视化实时监控目标蛋白在活细胞内表达及共定位的同时，可实时选择表达量最高的时期直接进行免疫共沉淀高效验证蛋白互作，极大提高蛋白互作验证的成功率，大幅度降低时间和经济成本。

技术领域本发明涉及蛋白互作技术的应用，尤其涉及一种基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的承载体和功能的执行者，蛋白通过彼此之间的相互作用构成蛋白质互作网络来参与生物信号传递、基因表达调节、能量和物质代谢及细胞周期调控等生命过程的各个环节。人们通过酵母双杂交、免疫共沉淀以及双分子荧光互补等技术的综合应用，研究蛋白互作的真实性，进而探索相关生理表型深层次的分子机理。其中，免疫共沉淀技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白互作的经典方法，既可以将目标蛋白作为诱饵初筛与之互作的可能猎物蛋白，也可以用于两个蛋白一对一互作的真实性验证。该方法验证的蛋白互作结果符合其在细胞内的真实互作情况。

为了便于检测互作蛋白，往往会在参试蛋白N端或C端人为添加标签蛋白。目前免疫共沉淀检测中应用最多的标签蛋白有GFP、GST、HA、Flag、His、Myc等。耦合上述标签蛋白后，只能通过步骤繁琐、耗时较长、对操作者技术要求较高、结果不容易稳定的WesternBlot验证蛋白表达后进行免疫共沉淀互作验证，且难以实时监控两种目标蛋白是否在外源细胞中得到充分表达。实验不稳定因素较多，对于阴性结果难下结论。

因此，迫切需要一种更方便、更直接进行免疫共沉淀验证蛋白互作的新途径，一方面可以通过荧光实时监测两种待验证互作蛋白的外源表达情况，便于判断外源蛋白是否表达，并选择蛋白表达量最高的时期进行后续免疫共沉淀互作验证，极大提高蛋白互作验证成功率，大幅度降低时间和经济成本。一方面需要在现有市售试剂中，能够找到成熟稳定的配套产品，便于后期各种蛋白互作验证实验的顺利开展，大大提高蛋白互作验证的效率和准确性。这对于高效利用免疫共沉淀技术进行蛋白互作验证具有十分重要的现实意义。

参考文献：

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