[发明专利]利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法

说明书

本发明公开了利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法。具体包括以下步骤：确定asap1a基因敲除的靶点位置即asap1a‑gRNA靶位点，体外转录获得asap1a‑gRNA，将asap1a‑gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼受精卵中，筛选培养获得稳定遗传的asap1a基因敲除突变体。本发明根据选择的asap1a基因的一段独特的高效率打靶区，利用CRISPR/Cas9技术使得斑马鱼中的asap1a基因被敲除并产生可遗传的asap1a基因敲除的斑马鱼，且本发明共获得了3种突变类型的asap1a基因敲除突变体斑马鱼品系，对研究asap1a基因的功能奠定动物模型基础。

技术领域

本发明涉及一种斑马鱼突变体技术领域，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统作为近年来新兴的一种基因编辑技术工具，其最初发现来源于细菌或古细菌在长期进化过程中形成的一种抵抗病毒和质粒侵袭的获得性免疫防御机制。CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)是指规律成簇的间隔短回文重复序列，能够靶向和干扰侵入的同源DNA序列。Cas9具有核酸外切酶的活性，在与crRNA(CRISPR-derived RNA)配对的序列靶位点附近剪切双链DNA。CRISPR/Cas9具体是将改造后的crRNA即gRNA(guide RNA)和Cas9 mRNA混合导入目标体系后引发DNA错配修复造成基因的突变，进而完成对靶位点DNA的定向切割。由于gRNA设计合成方便，且此系统对靶基因敲除效率的高效性，使得CRISPR/Cas9系统成为继锌指核酸酶(zincfinger endonuclease,ZFN)与转录激活样效应分子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)等敲除技术之后的又一种应用更为广泛的基因编辑技术，目前该技术广泛应用于细胞与动物模型的遗传学改造。

斑马鱼asap1a位于第二号染色体，CDS区约3400bp，29个外显子，编码蛋白约130kDa，与人ASAP1蛋白的同源性可达76％，目前关于斑马鱼asap1a基因的解释与功能验证未见报道。人类ASAP1(ADP ribosylation factor-GTPase activating protein)是ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors，Arf)的GTP酶激活蛋白，关于ASAP1的功能主要集中在与细胞内吞、细胞内膜泡转运与细胞骨架的运动调控方面，还与肿瘤的转移和扩散有关。ASAP1作为近年来新发现的结核易感基因，首先由剑桥大学研究者通过GWAS筛选得到，他们发现位于ASAP1内含子的11个SNP位点与结核病易感染性相关，之后国内研究者在不同地区、种族人群中进行了ASAP1关联性研究及连锁分析，且对ASAP1的功能和影响结核易感的机制在细胞水平上作出了初步探究，现主要集中在ASAP1蛋白表达对于免疫细胞迁徙能力的调控进而影响人类对于结核病的易感性。

斑马鱼作为近年来新型的模式生物日益成为体内试验理想的动物模型，且已经被逐渐用作研究疾病致病机理的良好材料。目前斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型被广泛应用于结核病致病机理的基础研究，此模型的显著优势在于海鱼分枝杆菌感染斑马鱼与结核分枝杆菌感染人的病理病程极其相似，并且斑马鱼拥有与人类相似的复杂的免疫系统，发育早期机体呈现透明状，这极大地方便了研究者实时观察和动态研究细菌感染与机体病理损伤过程，如：肉芽肿的形成和成熟。因此，在斑马鱼中利用基因编辑的手段对结核病易感基因改造，建立以斑马鱼为生物模型的结核病动物模型，对研究结核病易感基因的功能和结核病药物的筛选具有良好的指导意义。但是，目前国内鲜有利用反式遗传学手段在斑马鱼模型中研究结核易感病理的报道，也未有利用基因编辑技术产生斑马鱼asap1a基因突变体的报道。本专利则通过CRISPR/Cas9技术建立斑马鱼asap1a敲除突变体，为深入研究asap1a的基本功能和结核病易感机制提供材料基础。

发明内容