[发明专利]用于检测小鼠腺病毒K87株的PCR引物、PCR方法及试剂盒

说明书

本申请属于病原微生物的检测领域，涉及用于检测小鼠腺病毒K87的PCR引物、PCR方法及试剂盒；具体地，本申请提供了一对针对小鼠腺病毒K87株特异性好、灵敏度高的检测引物、荧光定量PCR方法和检测试剂盒。所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；所述PCR方法至少包括根据小鼠腺病毒K87株六邻体蛋白基因，通过Primer Premier 5设计获得所述上游引物和下游引物；所述试剂盒至少提供所述上游引物和下游引物，或者采用所述PCR方法。

技术领域

本申请属于病原微生物的检测领域，涉及小鼠腺病毒K87株的检测，尤其涉及用于检测小鼠腺病毒K87株的PCR引物、检测方法和该检测方法的应用。具体地，本申请提供了一对针对小鼠腺病毒K87株特异性好、灵敏度高的检测引物、荧光定量PCR方法和检测试剂盒。

背景技术

小鼠腺病毒(Murine adenovirus，MAdV)属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属，无包膜，是一种双链DNA的病毒。小鼠是小鼠腺病毒的自然宿主，该病毒在小鼠群体中多呈阴性感染，也可能引起致死疾病，其中实验小鼠主要通过粪便和尿液接触感染并传播。在20世纪60年代从小鼠体内分离该病毒，已被确认分类地位的株型有两种血清型：I型FL株(MAdV-1)与II型K87株(MAdV-2)。小鼠多数是感染FL株，一般表现为弓背、被毛粗糙、食欲下降等症状，新生乳鼠可致死。FL株感染可引发小鼠全身性感染，病毒侵入棕色脂肪、心肌、肾上腺、唾液腺、肾等处，对裸鼠的致病性较强。而II型K87株感染通常对新生乳鼠和成年鼠不发病，其造成肠道局部感染，经粪便不断向外排毒。2009年Boris Klempa等从黑线鼠肝悬浮液中分离出一种新的小鼠腺病毒，并获得完整的基因组序列，经比对，与小鼠腺病毒I型相似最高，但同时发现该病毒的多个基因组区域与小鼠腺病毒I型存在明显差异，被定义为小鼠腺病毒III型(MAdV-3)，新型MAdV-3在遗传性、血清上以及感染小鼠的趋向性上与MAdV-1不同，主要感染动物心脏组织。

小鼠腺病毒是无特定病原体动物SPF级小鼠要求检测项目之一。中国药典对鼠源性生物制品要求检测8种病毒，其中包括MAdV。而现有文献中小鼠腺病毒的鉴定方法常见的有血清检测学及PCR方法。国家标准规定的MAdV检测方法也属于血清学检测方法，但血清学方法存在假阳性问题，且不易诊断出早期感染等。

随着分子生物学的快速发展，分子检测技术也越来越被重视与应用。其中荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)因其快速、简便、特异度强、灵敏度高等诸多优点在病原体检测领域得到广泛应用。2014年王吉等针对E1B基因建立了建立小鼠腺病毒(MAdV)的RT-PCR检测方法，应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MAdV的检测，其中能检测小鼠腺病毒DNA最小模板浓度为1.67pg/μl，但该方法需要根据电泳后目的条带位置判定结果。2017年杜江涛等建立的针对MADV-3的PCR方法对质粒DNA最低检测限为4.5copies/反应，可用于大鼠、小鼠、长爪沙鼠等实验动物组织、粪便及鼠源性生物制品MAdV的检测。但是，目前还没有关于针对MAdV-2的特异性荧光定量PCR方法的报道。

虽然专利文献中存在用于检测小鼠腺病毒的PCR方法，申请人为舒泰神(北京)生物制药股份有限公司的专利申请CN102329890A和CN102399907A均涉及小鼠腺病毒的PCR方法，均是针对MAdV-1。广东省实验动物监测所申请公布号CN106566897A的专利，同样检测的小鼠腺病毒为MAdV-1。而浙江省医学科学院申请公布号为CN105861751A的专利，建立的是MAdV-3的PCR方法。尚未检索到用于检测MAdV-2的PCR方法。