[发明专利]一种烟草BAC文库及其构建和质量检测方法

说明书

本发明公开了一种烟草BAC文库及其构建和质量检测方法。所述烟草BAC文库以含有高抗黑胫病基因的烟草品种K236的近等基因系14‑60为材料提取基因组DNA，以pIndigoBAC536‑S为载体，大肠杆菌DH10B为宿主，包含414720个单克隆，插入的DNA片段大小为97‑160 kb，覆盖烟草基因组11倍以上。本发明所述的烟草BAC文库能够很好地覆盖烟草的基因组信息，可以作为提升和完善烟草基因组序列的重要资源，也为进一步克隆烟草重要功能基因与烟草新抗源的研究提供了重要资源。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种烟草BAC文库及其构建和质量检测方法。

背景技术

BAC文库是以细菌人工染色体载体为基础构建的一种插入片段在50~300 kb的基因组文库，每一个克隆都包含部分染色体的全部基因信息。BAC文库是基因组结构研究和功能基因分离的重要工具，在物理图谱构建、功能基因图位克隆、基因组全序列测定、比较基因组学分析等研究中发挥了重要作用。BAC文库已被广泛地应用于各物种的研究中，包括细菌, 动物和各种农作物。烟草BAC文库构建的报道较少，仅有烟草野生种绒毛状烟草，普通烟草Hicks Broadleaf和SR1。由于早期文库构建受到技术和成本限制，很少开展高质量、大容量的BAC文库构建工作，因此这些BAC文库的具体参数、检测标准以及质量评价鲜有报道。

在现有的BAC文库构建技术中，浓度适宜的基因组DNA是获得高质量大片段DNA的必要条件，低浓度的基因组DNA往往很难成功获得大片段DNA来构建BAC文库，基因组DNA浓度过高也会增加实验的难度，比如会导致大片段DNA在脉冲场中很难完全分离，很多小片段DNA与大片段DNA通过PFGE分不开，DNA堆积在一起。由于外源DNA片段越大，越难与BAC载体连接，而同样条件下小片段外源DNA却很容易与载体相连，所构建出来的BAC文库中会出现非常多的小片段，严重影响BAC文库的质量。高分子量的大小均一的插入片段也是构建BAC文库的关键环节之一，如果在实验中内切酶过量，会导致非特异性酶切，会产生很高比例的假阳性，从而导致整个文库空载率过高。

此外，黑胫病是土壤传播的真菌性病害，是烟草生产最具毁灭性病害之一，严重影响全世界烟叶生产安全。育种家利用自然或诱导变异培育抗病品种，种植抗病品种是解决黑胫病导致生产损失的最有效方法。因此，构建一个含有抗性基因的烟草BAC文库，可为挖掘抗性基因功能以及烟叶品质形成机理奠定重要基础。

为此，本发明研发了以携带抗性基因的烟草品种K326的近等基因系为材料，通过二次筛选DNA片段大小和浓度获得的烟草BAC文库及其构建和质量检测方法。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草BAC文库，所述烟草BAC文库以含有高抗黑胫病基因的烟草品种K236的近等基因系14-60为材料提取基因组DNA，以pIndigoBAC536-S为载体，大肠杆菌DH10B为宿主，包含414720个单克隆，插入的DNA片段大小为97-160 kb，覆盖烟草基因组11倍以上。

本发明的第二目的在于提供一种烟草BAC文库的构建方法，所述构建方法包括以下步骤。

（1）烟草基因组大片段DNA提取：采用低熔点琼脂糖包埋技术提取基因组大片段DNA。