[发明专利]一种赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法

权利要求书

1.一种赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将金电极AuE依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，并依次在乙醇和水中超声以清除表面残留，然后在硫酸溶液中使用循环伏安对电极进行电化学清洗；

(2)将二茂铁标记的互补DNA即Fc-cDNA修饰到经步骤(1)处理的电极上，利用Au-S键将Fc-cDNA固定在金电极表面；

(3)将巯基己醇MCH修饰在步骤(2)处理过的电极上，以封闭金的非特异性结合位点；

(4)将赭曲霉毒素A的适配体Apt修饰在步骤(3)处理过的电极上，利用其与cDNA的杂交反应形成双链DNA；

(5)将辅助互补DNA即hDNA修饰在步骤(4)处理过的电极上，利用杂交反应进一步形成更长的双链DNA；

(6)将步骤(5)得到的电极浸泡在不同浓度的赭曲霉毒素A即OTA的标准溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干；

(7)将步骤(6)得到的电极浸泡在亚甲蓝MB溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为MB/OTA/hDNA/Apt/MCH/Fc-cDNA/AuE-1；在三电极体系中，将得到的电极MB/OTA/hDNA/Apt/MCH/Fc-cDNA/AuE-1作为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，以磷酸盐缓冲溶液为电解液，进行电化学交流伏安曲线测量，检测比率信号I_Fc/I_MB，建立赭曲霉毒素A溶液浓度与比率信号I_Fc/I_MB的对应关系的标准线性曲线；

(8)待测样品中赭曲霉毒素A浓度的检测：

将步骤(5)得到的电极浸泡在赭曲霉毒素A的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干；然后再浸泡在亚甲蓝MB溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为MB/OTA/hDNA/Apt/MCH/Fc-cDNA/AuE-2；在三电极体系中，将得到的电极MB/OTA/hDNA/Apt/MCH/Fc-cDNA/AuE-2作为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，以磷酸盐缓冲溶液为电解液，进行电化学交流伏安曲线ACV测量，检测比率信号I_Fc/I_MB，代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度。

2.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(1)中，金电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm；所述循环伏安的扫描速率为100mV/s，扫描电位范围为-0.2-1.6V，硫酸的浓度为0.1M。

3.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(2)中，Fc-cDNA的用量为6μL，浓度为1μM，修饰时间为室温下8小时。

4.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(3)中，MCH的用量为6μL，浓度为1mM，孵育时间为室温下1小时。

5.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(4)中，Aptamer的用量为6μL，浓度为2μM，反应时间为1小时，温度37℃。

6.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(5)中，hDNA的用量为6μL，浓度为2μM，反应时间为1小时，温度37℃。

7.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(6)中，电极浸泡的时间为40分钟，赭曲霉毒素A的标准溶液的浓度为1×10^-11～1×10^-8g/mL。

8.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(7)中，MB的浓度为2μM，浸泡时间为10分钟；磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01M，pH为7.4；ACV测量的电位范围为-0.5-0.7V，频率为25Hz。

9.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(8)中，电极浸泡在赭曲霉毒素A的待测溶液中浸泡的时间为40分钟；MB的浓度为2μM，浸泡在MB中的时间为10分钟；磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01M，pH为7.4；ACV测量的电位范围为-0.5-0.7V，频率为25Hz。