[发明专利]一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建质粒pMHS-NrtR_ms：

1-1）以耻垢分枝杆菌mc²155基因组DNA为模板、SEQ ID No.1~4所示的引物对进行PCR扩增，电泳分离后经Van91I限制性内切酶酶切备用；

1-2）将含有pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株扩大培养，然后收集菌体，抽提质粒，质粒经Van91I限制性内切酶酶切后电泳分离，回收1600 bp区间和3600 bp区间的DNA片段；

1-3）将步骤1-1与1-2所获得的DNA片段经T4 DNA连接酶16ºC反应过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞扩大培养，抽提质粒后获得质粒pMHS-NrtR_ms；

2）构建质粒pHAGE-NrtR_ms：

2-1）分别扩大培养含有质粒pHAGE和质粒pMHS-NrtR_ms的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒，两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4 DNA连接酶16ºC反应过夜，连接产物使用包装试剂盒包装并转化至大肠杆菌HB101感受态细胞扩大培养，抽提质粒后获得质粒pHAGE-NrtR_ms；

3）制备重组TM4噬菌体：

3-1）扩大培养耻垢分枝杆菌mc²155，振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，用预冷的10%无菌甘油洗涤菌体，然后加入预冷的10%的甘油重悬菌体，-80ºC冻存备用；

3-2）将质粒pHAGE-NrtR_ms转入耻垢分枝杆菌mc²155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，转化后加入7H9液体培养基，37ºC培养箱孵育过夜，将37ºC放置后的菌液加到含有top agar的EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上，平板置30ºC培养箱培养2-3天，获得重组TM4噬菌体；

4）构建nrtR_ms基因缺失的耻垢分枝杆菌mc²100：

7H9液体培养基培养耻垢分枝杆菌mc²155至对数生长期，离心收集菌体，用MP buffer洗涤离心获得菌体，然后用MP buffer重悬菌体，将重悬的耻垢分枝杆菌mc²155与滴度为10¹⁰PFU的重组TM4噬菌体以1:1体积混合后培养箱孵育，然后离心收集菌体弃上清后用7H9液体培养基重悬，放置培养箱孵育过夜，再次离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板培养，获得分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌mc²100；

5）nudC基因的扩增及构建质粒pMV361-NudC_ms：

5-1）nudc基因的扩增：以耻垢分枝杆菌mc²155基因组DNA为模板，使用SEQ ID No.9~10所示的引物对PCR扩增nudC基因ORF序列，PCR产物经电泳分离回收后使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，回收酶切后的DNA备用；

5-2）酶切：LB培养含pMV361质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒后使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，然后进行电泳分离，回收线性化的质粒；

5-3）连接：酶切回收的DNA片段和经同样酶切回收的线性化质粒pMV361经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜，获得质粒pMV361-NudC_ms，所述LB固体平板含100μg/mL硫酸卡那霉素；

6）构建nrtR_ms基因敲除且nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌：

6-1）制备突变耻垢分枝杆菌mc²100感受态细胞：7H9液体培养基培养步骤4获得的突变耻垢分枝杆菌mc²100至对数生长期，离心收集菌体，将菌体用预冷的10%无菌甘油至少洗涤两次，最后加入适量预冷的10%的甘油，吹匀菌体后，分装置-80℃冻存备用；

6-2）转化突变耻垢分枝杆菌mc²100：将质粒pMV361-NudC_ms转入突变耻垢分枝杆菌mc²100电转感受态细胞中，冰上孵育10 min，然后电击转化，然后加入7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，然后取适量培养液涂布7H10固体平板，平板置37℃培养箱培养3～5天，获得产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌，所述7H10固体平板含50μg/mL硫酸卡那霉素。