[发明专利]霜霉病菌培养和观察的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及霜霉病菌培养和观察的方法。霜霉病菌的采集；孢子囊悬浮液的制备；孢子囊悬浮液的培养。通过反复试验获得了一种能够诱导黄瓜霜霉病菌孢子囊萌发释放游动孢子、游动孢子通过运动和形态变化形成静止孢子，静止孢子萌发形成附着胞，附着胞萌发产生侵染丝的技术。该技术可为研究者进行霜霉病菌生物学基础、抗病性鉴定、杀菌剂筛选等的深入研究提供了有效的技术。通过该方法研究者可实现对霜霉菌游动孢子数量，形态变化以及形成侵染体数量的定量统计和监测，还可以实现杀菌剂作用机制的研究。清楚观察到霜霉病菌侵入寄主前必须经历的几个发育阶段。系统的观察方法将能够为该病菌的对症药物的防治提供第一手的资料。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及霜霉病菌培养和观察的方 法。

背景技术

黄瓜霜霉病是黄瓜生产中的重要病害,其传播流行速度很快,叶 片上形成的病斑常导致叶片组织干枯，对黄瓜生产造成严重的影响。 国内外对黄瓜霜霉病田间流行、与环境温湿度相关性，预警模型的建 立等展开了大量研究。但是对黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)生物学基础的研究相对薄弱，重要的原因是缺少相关的观察试验技术，制约了对霜霉病菌生物学基础的研究。黄瓜霜霉病菌作 为卵菌，由于不能人工培养，在一定程度上限制了对病原菌生物学基 础的研究，加之霜霉病菌无性繁殖孢子为游动孢子，游动孢子需要经 历多个发育阶段才能成功侵入寄主，因此，游动孢子的形成、运动规 律、休止、萌发等环节成为深入研究的必不可少的观察内容。由于缺 少相关的观察方法，制约了该过程的观察，未能获得比较理想的试验 结果，也未能得出能够反映霜霉病菌生长发育的最佳温度范围。截止 目前未发现有相关文献的系统报道。大量的相关性分析结果依靠人工 接种叶片促使其发病获得不同时间侵染至显症的温湿度范围。因此病 菌需要经历多个阶段未能如期观察到。建立系统的观察方法，是当下 急需解决的关键问题。通过查阅文献，有关霜霉病菌生物学基础的相 关研究匮乏，重要的原因就是缺少观察技术的支撑。而现有的技术仍 然是通过采集田间病叶获得病原菌的繁殖体，利用人工接种叶片，给与适宜的发病条件促进发病，进而获得病害发生需要的最佳的温湿度 等，推断出适宜于霜霉病菌生长发育温度范围。不能对霜霉病菌孢子 囊释放游动孢子、游动孢子数量的统计，游动、形成静止孢子以及萌 发形成附着胞等侵入寄主前的5个关键发育环节未见有详细的报道。 进而限制了对霜霉病菌侵入寄主前活动过程的观察，导致相关的研究 进展缓慢。

发明内容

发明的目的：为了提供一种效果更好的霜霉病菌培养和观察的方 法，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。

为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：

霜霉病菌培养和观察的方法，其特征在于，包含如下步骤：

霜霉病菌的采集：田间采集新鲜的霜霉病菌病斑，观察病斑背面 长出的灰白色-灰黑色的霉层即霜霉病菌的孢囊梗和孢子囊；装入干 净塑料袋中，带回实验室备用；

孢子囊悬浮液的制备：将田间采回的霜霉病病叶，置于洁净的工 作台上，肉眼仔细观察，以鲜黄色病斑叶背产生的霉层为菌种，用洁 净的毛笔，轻轻顺势刷取叶背的霉层，顺势推送在装有灭菌或蒸馏水 的离心管或指形瓶中，反复多次刷取，摇匀离心管或指形瓶，同时吸 取含有孢子囊的悬浮液，滴于凹玻片上，盖上载玻片，置于显微镜下 观察，观察孢子囊的个数和发育情况；

孢子囊悬浮液的培养：将含有孢子囊悬浮液的离心管或指形瓶置 于有光照，温度为15℃-20℃度的培养箱中预培养1h。

本发明进一步技术方案在于，在孢子囊悬浮液的培养后还包含如下步 骤，孢子囊悬浮液置于低温预培养1h后，再将孢子囊悬浮液置于温 度为23-26度的室温下培养1h。

本发明进一步技术方案在于，取出置于常温下，采用凹玻片悬滴法制 成玻片，置于显微镜下观察：首先低倍镜下观察找到需要观察的视野 后，再在20倍或40倍物镜下观察。