[发明专利]猪病毒性腹泻病病原的五重RT-PCR检测方法

权利要求书

1.猪病毒性腹泻病病原的五重RT-PCR检测方法，所述检测方法是非疾病诊断目的，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，设计5种病毒的特异性RT - PCR检测引物对序列：

用于检测猪德尔塔冠状病毒PDCoV的引物对序列：上游引物PD - Detection F的引物序列为5’ - TACAACCTAAGGCTAACCAAC - 3’，

下游引物PD - DetectionR的引物序列为5’ - ACAACTTTACCTGCCTTACATA - 3’；

用于检测猪凸隆病毒PToV的引物对序列：

上游引物PT - Detection F的引物序列为5’ - TCCTCGTGACACTTTATCTCA - 3’，

下游引物PT - Detection R的引物序列为5’ - TTCACTAACATCCTCTACCACA - 3’；

用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的引物对序列：

上游引物PE - DetectionF的引物序列为5’ - TGAAGACTTTTGACAATCCAC - 3’，

下游引物PE - Detection R的引物序列为5’ - ACACAGCATTACCATCTAC - 3’；

用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒Sads-CoV的引物对序列：

上游引物SD - Detection F的引物序列为5’ - GCTCAGTACATCTTTTCAACT - 3’，

下游引物SD - Detection R的引物序列为5’ - CATAGTCATACTCGCTACCTT - 3’；

用于检测传染性胃肠炎病毒TGEV的引物对序列：

上游引物TG - Detection F的引物序列为5’ - TACATACCACCTGCTTATGCAA - 3’，下游引物TG - Detection R 的引物序列为5’ - TACACAATTGACCAATCAACAC - 3’；

第二步，获取待检样品的cDNA：提取腹泻粪便样品或肠道组织的总RNA，反转录为cDNA模板；

第三步，使用5对RT - PCR引物进行检测：将所述 PDCoV、PToV、PEDV、Sads-CoV和TGEV的引物对置于PCR反应体系中，以第二步中cDNA作为模板，进行PCR扩增；

第四步：用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，依据电泳条带出现的位置即可确定该样品中是否存在PDCoV、PToV、PEDV、Sads-CoV与TGEV；当存在148bp的条带时即可确定该样品中存在PDCoV、当存在274bp的条带时即可确定该样品中存在PToV、当存在411bp的条带时即可确定该样品中存在PEDV、当存在574bp的条带时即可确定该样品中存在Sads-CoV、当存在833bp的条带时即可确定该样品中存在TGEV。

2.根据权利要求1所述的猪病毒性腹泻病病原的五重RT-PCR检测方法，其特征在于：所述第二步中反转录使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit进行，其反应总体系为20 µL，包括：1 µL Random Hexamer Primer, 1 µL OligodT₁₈ Primer, 5 µLnuclease-free Water，5 µL总RNA，混匀后65 ℃孵育5 min，冰浴3 min，继续加入：4 µL5×Reaction Buffer、2 µL 10 mM dNTP预混液、1 µL RevertAid M-MuLV Reversetranscriptase和1 µL RiboLock RNase Inhibitor。