[发明专利]人重组甲硫氨酸亚砜还原酶A蛋白的结构和构建方法

权利要求书

1.一种人重组甲硫氨酸亚砜还原酶A蛋白的结构，其特征在于：

所述结构为重组的EpK-MsrA融合蛋白，其全长序列为280个氨基酸残基，所述EpK-MsrA融合蛋白基本结构，如SEQ ID NO.1所示，

其中，6个His标签表现为His His His His His His；

所述结构具体包括一段EpK肽的组成结构，如SEQ ID NO.2所示；

人源性MsrA的结构为无信号肽的213个氨基酸链，通过BamHI限制性内切酶识别序列的编码氨基酸连接成一完整的EpK-MsrA融合蛋白多肽链；

还包括在EpK肽前端的一段人源性载脂蛋白E即apoE的分泌肽序列，其结构如SEQ IDNO.3所示；

通过6个His标签与EpK连接。

2.一种如权利要求1所述人重组甲硫氨酸亚砜还原酶A蛋白结构的构建方法，其特征在于：利用apoE的一段低密度脂蛋白受体即LDLR结合域和一段脂质结合域，经过6个赖氨酸连接的特征序列，在EpK序列之前连接了apoE信号肽和6个His标签，其基本结构如SEQ IDNO.4所示；

通过DNA合成仪合成并连接至pUC19载体内，并利用特定引物合成对pUC19重组载体进行定点诱变聚合酶链反应，将含信号肽及EpK的序列进行两端限制性核酸内切酶PacI、BamHI的改构，鉴定为成功构建的含信号肽-EpK的pUC18T重组体；

利用实验室前期将人源性MsrA构建于pWPI-GFP慢病毒载体中形成的pWPI-GFP-MsrA重组载体，其MsrA序列两端拥有添加的BamHI、PacI酶切位点；

对提纯的以上两种重组载体分别进行BamHI、PacI双酶切，酶切完成后通过琼脂糖凝胶电泳后的胶回收方法获得信号肽-EpK及MsrA的DNA片段，并连接目的片段。

3.根据权利要求2所述的人重组甲硫氨酸亚砜还原酶A蛋白的构建方法，其特征在于：所述一段apoE的LDLR结合域和一段脂质结合域，为apoE的第141-150位氨基酸肽段和第234-254位氨基酸肽段；

所述前期构建的pWPI-GFP-MsrA，为含有639bp的人源性MsrA的cDNA片段；

所述连接目的片段，包括于20μl的T₄DNA连接酶反应体系连接目的片段。

4.根据权利要求2或3所述的人重组甲硫氨酸亚砜还原酶A蛋白的构建方法，其特征在于：所述方法还包括：

酶连接反应后采用聚合酶链反应扩增及PacI单酶切，然后琼脂糖凝胶电泳后鉴定为信号肽-EpK-MsrA的DNA片段长度；

利用基因工程技术构建重组原核表达载体pET28a-EpK-MsrA，于大肠杆菌中表达的重组EpK-MsrA融合蛋白，经过NTA-Ni柱亲和层析得到纯化的EpK-MsrA融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的人重组甲硫氨酸亚砜还原酶A蛋白的构建方法，其特征在于：因采用含His-标签的pET28a原核表达载体及大肠杆菌宿主菌，所述EpK-MsrA基本结构，如SEQ ID NO.5所示。