[发明专利]一种结核分枝杆菌EEC融合蛋白、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种结核分枝杆菌EEC融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO.8；编码该多肽的多核苷酸，为序列表中的SEQ ID NO.7所示；包含该多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及该融合蛋白的制备，以及其在结核病辅助诊断、结核菌感染筛查和结核病疫苗研制中的作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌EEC融合蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

结核病仍然是重大的公共卫生问题，结核病控制已得到WHO和各国政府的高度重视。但非结核分枝杆菌(NTM)感染及其引起的NTM病呈上升趋势，一些结核病低发病地区，NTM病例数多于结核病；NTM在我国属于非法定上报疾病，其具体感染情况未知。我国80％结核病为菌阴结核，需要鉴别菌阴结核与NTM病，目前缺乏NTM感染及其NTM病的免疫学检测方法，PPD-B(胞内分枝杆菌蛋白纯化衍生物)在国内没有上市。

免疫学诊断方法是基于免疫学原理诊断机体的免疫状态，分为免疫血清学诊断和免疫细胞学诊断。结核病免疫细胞学诊断方法有传统的结核菌素试验(TST)和干扰素释放试验(IGRA)。TST是指通过皮内注射结核菌素，并根据注射部位的皮肤状况诊断结核杆菌感染所致IV型超敏反应的皮内试验。结核菌素是结核杆菌的菌体成分，包括旧结核菌素(OT)和纯蛋白衍生物(PPD)。OT因未经过提纯，易产生副反应。PPD由结核菌或BCG培养8-10周，培养物经121℃灭菌30min后过滤，滤液经三氯醋酸、饱和硫酸铵沉淀，沉淀复溶后透析获得。PPD与OT相比极大降低了副反应，但与多种分枝杆菌抗原存在交叉，特异性有待提高。

WHO在2018年结核病年报首次推荐TST或IGRA作为结核潜伏感染的诊断方法(WHO,TB report,2018)。IGRA是通过外周血或外周血单核淋巴细胞在体外经结核分枝杆菌抗原刺激，检测分泌的IFN-γ。根据IFN-γ检测方法，IGRA分为ELISA-IGRA和ELISPOT-IGRA两种，ELISA-IGRA是外周血在体外刺激培养，ELISA检测培养上清的IFN-γ含量；需要离心机、培养箱、酶标仪，ELISA-IFN-γ试剂盒等。ELISPOT-IGRA是外周血单核淋巴细胞在体外刺培养，酶联斑点法检测分泌IFN-γ的细胞数；操作较复杂，成本高，需要离心机、细胞计数仪、CO2培养箱、斑点计数仪、IFN-γ单抗包被的ELISPOT板、淋巴细胞分离液、细胞培养液、血清、离心管等。IGRA试验所涉及的体外刺激抗原均为RD1区抗原，RD1编码基因存在结核杆菌基因组中，而在卡介苗和大部分NTM基因组中缺少，因此IGRA特异性高于PPD皮试。ELISPOT-IGRA灵敏度高但不适合大规模筛查，ELISA-IGRA适合大规模筛查，但存在阳性和阴性无法鉴定的灰区数据。另一方面IGRA的检测成本高、对设备和实验操作者要求较高，该方法不适合发展中国家的基层推广。TST只需注射和测量，从业人员经过培训均能很快掌握，适合随时和大规模筛查。提高TST诊断试剂的特异度，TST将是一种有效、低廉、方便的结核杆菌感染筛查的免疫学诊断方法。