[发明专利]利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法

说明书

本发明公开了一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，包括步骤为：用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体；用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，得到3’端为单链的DNA产物；将产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。通过上述方式，本发明能用于基因工程领域，特别是重组DNA的构建与氨基酸定点突变方面的应用，同时本方法也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗、基因克隆等领域。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法。

背景技术

基因克隆与氨基酸定点突变技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术首先利用限制性核酸内切酶消化目标基因DNA片段与质粒载体，然后DNA连接酶连接环化目标基因与质粒，形成完整的重组质粒。由于限制性核酸内切酶消化反应消化不完全，常常造成含有目标基因的阳性重组质粒百分比低于10%，甚至克隆失败。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。这些方法都依赖于目标基因与质粒载体DNA之间的重组反应，形成环状（带DNA缺口）质粒。

其中基于尿嘧啶修饰引物和尿嘧啶DNA糖苷酶的基因克隆技术，是一种高效的连接酶非依赖型基因重组技术。尿嘧啶DNA糖苷酶能够使带尿嘧啶的DNA片段产生一定长度的单链DNA，从而使目的基因片段和载体二者之间在末端彼此配对，形成稳定的双链DNA区，即环状重组DNA。转化大肠杆菌后，该双链DNA区域的缺口会被大肠杆菌修复，最终形成完整的重组DNA分子。该方法中线性化质粒和目的基因的获得需要通过尿嘧啶修饰引物进行PCR扩增。但PCR扩增只能利用Taq DNA聚合酶，而Taq DNA聚合酶的忠实性很低，会在扩增的线性化质粒和基因片段中引入一些错误碱基，对长片段目的基因和质粒而言这一问题尤为严重。由于重组表达载体需要目的基因和表达载体的DNA序列高度保守，不能具有碱基突变，因此该方法不适合于构建表达载体，而高忠实性的DNA聚合酶活性受到dU的严重抑制，不能够扩增得到含dU碱基的全长PCR产物，也就无法进行基因克隆。dU引物的这一问题严重限制了该方法的应用场所。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，能用于基因工程领域，特别是重组DNA的构建与氨基酸定点突变方面的应用，同时本方法也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗、基因克隆等领域。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，包括步骤为：（1）用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体，得到目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物；（2）将目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，使目标基因和质粒载体的两端产生12-30bp 单链同源区域；（3）将步骤（2）得到的产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述dU修饰引物的序列特征为：（a）扩增目标基因和质粒载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（b）扩增目标基因和质粒载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（c）引物长度40-50个碱基，3’端下游的18-25个碱基序列与目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对；（d）dU碱基位于1-30位碱基区，且每隔5-10个碱基为一个dU碱基。