[发明专利]4-木糖醇脱氢酶突变体及其用途

说明书

本发明公开了一种4‑木糖醇脱氢酶突变体及其用途。该4‑木糖醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第41位亮氨酸突变为甲硫氨酸、第179位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸的氨基酸序列。该4‑木糖醇脱氢酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。将该基因导入大肠杆菌获得含有该基因的基因工程菌，实现重组4‑木糖醇脱氢酶的制备，本发明提供的4‑木糖醇脱氢酶突变体热稳定性大幅度提高，可用于高效转化木糖醇制备L‑木酮糖。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种4-木糖醇脱氢酶突变体及其用途。

背景技术

根据国际糖协会(ISRS)对稀有糖的定义:稀有糖是“在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。稀有糖虽然在自然界中含量少，但因具有潜在的生物活性和低毒性使其在膳食、保健、医药等领域发挥着重要作用。随着生活品质的提高，人们对膳食和健康的要求越来越高，对食品安全性和药物低毒性越来越关注。L-木酮糖(L-xylulose)是存在于多种生物体代谢途径的戊酮糖，其在自然界中浓度很低，是一种稀有糖。口服L-木酮糖可以抑制肠道蔗糖酶和麦芽糖酶活性，能有效地抑制餐后血糖升高，是降血糖食品的理想活性成分，L-木酮糖用于肿瘤治疗时能显著抑制恶性肿瘤细胞。此外，L-木酮糖可以作为其他稀有糖生产的前体物质。例如，L-木酮糖可以通过L-鼠李糖异构酶转化生产L-木糖和L-来苏糖。

根据Izumoring理论可以通过多种途径获得L-木酮糖。例如L-木糖和L-来苏糖通过醛糖异构酶的异构作用转化为L-木酮糖；L-核酮糖通过D-塔格糖3-差向异构酶作用于C-3位置羟基，通过差向异构作用转化为L-木酮糖；L-阿拉伯糖醇和木糖醇通过氧化还原酶的氧化作用转化为L-木酮糖。其中L-木糖、L-来苏糖、L-核酮糖和L-阿拉伯糖醇在自然界中含量极少，难以分离纯化且价格极其昂贵，无疑会提高L-木酮糖的生产成本。而木糖醇作为目前在商业领域应用最为广泛的稀有糖之一，已经实现工业化生产，价格相对低廉，易于获得。以木糖醇为底物，使得L-木酮糖的生产成本大大降低。

生物转化生产L-木酮糖，主要是通过菌体静息细胞催化氧化底物木糖醇。通常先培养菌体达到一定的浓度，通过过滤或离心方法收集并且洗涤培养的菌体细胞，再将这些细胞悬浮在含底物(主要为木糖醇)的反应体系中，在一定温度、pH和振荡条件下进行转化生产。该法反应条件温和，环境友好，成本较低且产品纯度高，易于实现规模化生产，基于长远考虑，生物转化法是最具潜力的，也是L-木酮糖生产技术的主要研究方向。微生物转化法生产L-木酮糖的研究最早见于1985年，美国康奈尔大学Doten等人在研究细菌性植物病原菌噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora，现更名为菠萝泛菌(Pantoea ananatis))的戊糖醇代谢过程中分离到1株能以木糖醇为唯一碳源的自发突变株(Doten et al.，1985)，该突变菌株检测到具有4-木糖醇脱氢酶(XDH)和L-木酮糖激酶的活性，这种新型4-木糖醇脱氢酶，木糖醇为底物K_M达到48Mm，可以催化NADH为辅酶的L-木酮糖还原反应。随后，他们通过转位子突变诱变筛选得到木糖醇阴性突变体突变株，该突变株可以合成4-木糖醇脱氢酶，同时缺乏L-木酮糖激酶活性。突变体可以转化木糖醇生成L-木酮糖，而不能进一步磷酸化L-木酮糖，进入磷酸戊糖途径(Doten et al.，1985)。2006年芬兰赫尔辛基大学Aarnikunnas等人成功将菠萝泛菌中的4-木糖醇脱氢酶基因分离并在大肠杆菌(E.coli)中进行了表达，这是首次细菌来源的4-木糖醇脱氢酶基因克隆并表达成功。通过对4-木糖醇脱氢酶影响因素的研究表明，XDH受到镁离子调节，其最适p H在碱性范围(Aarnikunnas etal.，2006)。通过响应面法优化重组大肠杆菌的静息细胞转化木糖醇生成L-木酮糖的影响因素，其在生物反应器中以250g/L木糖醇为底物时，L-木酮糖的生产力达到1.09g/(gh)(Usvalampiet al.，2009)。