[发明专利]一种用于活细胞成像的高分辨率全息显微镜及方法

说明书

本发明公开了一种用于活细胞成像的高分辨率全息显微镜及方法，属于全息显微成像技术领域。在全息光路中，次级点光源经过活细胞样品时发生衍射的物光和未发生衍射的参考光产生干涉，形成同轴全息图，图像经高倍显微物镜放大后由CCD相机接收并存储于计算机中，利用计算机数值重建得到再现图像。本发明使用低倍显微物镜将平行光源转化为次级点光源结合记录过程中物光、参考光同向，充分利用了CCD相机的有限空间带宽，大大提高了全息显微镜系统的分辨率，使用三维微米级位移平台精确调节显微分辨率并且通过缩短记录距离接收到更多干涉外圈条纹，其中包括对重建图像起关键作用的样本高频信息，结合CCD相机前的高倍显微物镜，能够对活细胞样品实现非接触、无损伤、快速、定量的高分辨率全息显微成像。

技术领域

本发明涉及全息显微成像技术领域，特别涉及一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜及方法。

背景技术

传统的光学显微镜在测量样品时，由于探测器只能记录物光波的强度信息，所以只能获得物体的二维形貌。电子显微镜和扫描探针显微镜由于在测量前需要对被测样品进行预处理，扫描过程需要一定的时间，因此无法对样品进行非接触、无损伤、快速、实时测量。近些年来发展的数字全息显微成像技术，对生物样品成像具有非接触、无损伤、快速、实时、定量等独特优势，克服了传统显微成像技术应用在日益发展的生物医学领域中存在的局限性。

同轴全息显微术利用光源经过物体时发生衍射的物光和未衍射的参考光相干叠加形成全息图，并由CCD相机对全息图进行数字记录，由于全息图记录了物光波前的振幅和相位信息，因此利用计算机进行数值重建可以准确还原出物体的振幅和三维相位信息，从而定量获取被测物体的三维形貌。由于它不需要对被测样品进行特殊预处理，所以被广泛应用于生物样品尤其是活细胞样品的测量和可视化观测。

一般同轴全息显微镜系统主要包括激光器、针孔或者显微物镜、CCD相机。激光器发出的相干光源通过针孔或者显微物镜使平行光源聚焦成次级点光源，充分利用了CCD的有限空间带宽，提高了系统分辨率，次级点光源经过活细胞样品时，一部分发生衍射的光称为物光，另一部分未衍射的光称为参考光，两部分光束发生干涉形成全息图，通过调节记录距离或者加入高倍显微物镜对全息图放大，放大后的图像被CCD相机接收并存储于计算机，利用计算机进行数值重建。

同样被广泛使用的离轴数字全息显微镜，系统光路具有结构复杂、光源相干性要求高、后端光学元件多、不易调节等缺点；且其物光、参考光分离，提高了干涉条纹密度，没有充分利用CCD相机的有限空间带宽^[1-2]，因此系统分辨率也很难得到进一步提高；而且光路中样本与记录面间的距离很难靠得很近，不利于记录样本的高频信息。同类型的同轴全息显微镜在成像分辨率方面可以达到十几微米到一微米的分辨率^[3-5]，而本系统经过USAF1951和周期为0.5um的光栅结构测试分析得到本发明可以达到低于0.5um的横向分辨率，更有利于观察活细胞样品的生物特征。

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[3]Shiraki A,Taniguchi Y,Shimobaba T,et al.Handheld and low-costdigital holographic microscopy[J].Physics,2012.