[发明专利]增强靶基因沉默效率的siRNA分子及其应用

说明书

本发明公开了一种增强靶基因沉默效率的siRNA分子，其正义链除3’末端碱基外，所有核苷酸中的戊糖结构上的2’‑OH位均被2’‑氟或2’‑甲氧基取代；其反义链5’端碱基进行磷酸化修饰，起始后奇数位碱基用2’‑甲氧基修饰，偶数位碱基用2’‑氟修饰，且反义链3’端数起与靶基因互补的前3个碱基都用2’‑甲氧基修饰；该siRNA分子反义链3’可用磷酸酯键或硫代磷酸酯键连接1‑10个脱氧胸腺嘧啶，且确保含有2个硫代磷酸酯键修饰核苷酸骨架。本发明可用于沉默细胞因子VEGFR2、PIK3CB或EGFR的基因表达，组织靶向性分子修饰siRNA分子以提高转染效率，抑制内体质膜循环相关细胞因子功能，增加其基因沉默效率；同时这些siRNA分子单独或联合使用可用于治疗因基因突变或过表达引起的疾病。

技术领域

本发明涉及小干扰RNA分子的核苷酸序列及其增强基因沉默的技术。

背景技术

小干扰RNA分子（Small interfering RNA, siRNA)是RNA干扰理论（2006年诺贝尔生理医学奖）的效应分子，能在细胞质或细胞核内特异性沉默引起疾病的过表达及突变基因，具有治疗疾病的应用前景(Sullenger B A,et al. Science. 2016; 352(6292):1417-1420.)。siRNA分子是由两条单链RNA分子因序列全部互补或部分互补后形成的完全对称的双链结构或不对称双链结构，其中的一条链可与细胞内的靶RNA核苷酸序列部分或完全互补，称为指导链（guide strand）或反义链(antisense strand)。另一条链称为伴随链（passenger strand）或正义链(sense strand)；带负电荷，具有生物大分子结构特性。体内系统途径应用siRNA分子治疗疾病时存在稳定性差（易被核酸酶降解）、组织靶向性差、脱靶效应、易被肝肾清除、免疫原性、难以穿过细胞膜被靶细胞摄取、及难以从细胞内体（endosome)中逃逸等问题。即使局部给药例如眼内、皮肤、脑内、关节腔内、或其它组织局部给予siRNA时，依然存在难以穿过细胞膜被靶细胞摄取、及难以从细胞内体中逃逸等问题。这些问题直接制约着siRNA分子的临床转化(Lee SJ,et al. Advanced Drug DeliveryReviews.2016; 104:2-15.)。

要获得细胞内高效的沉默活性，首先要获得高沉默效率的siRNA分子的基本序列结构，然后参考对寡核酸化学修饰的理论方法，对siRNA分子结构中的核苷酸及骨架进行选择性修饰，可大大提高其在血液中的稳定性、降低免疫原性、减少脱靶效应、延缓肝肾清除。同时因siRNA分子量大且带负电荷，难以被靶细胞高效摄取，但经修饰的siRNA分子易于穿过细胞膜及从内体中逃逸进入胞浆内增强基因沉默活性（Khvorova A, et al.NatBiotechnol. 2017 ;35(3):238-248.)。