[发明专利]一种重组酯酶、基因、工程菌及拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的应用

说明书

本发明提供了一种立体选择性重组酯酶、编码基因、载体、工程菌及其拆分(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯的应用；利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂同时催化拆分(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯，生成(S)‑吲哚啉‑2‑甲酸，转化率达45％左右，产物光学纯度都在96％以上。

(一)技术领域

本发明涉及一种立体选择性酯酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。

(二)背景技术

(S)-吲哚啉-2-甲酸及其某些化合物是目前实验及临床阶段的许多新药中间体。如法国Servier公司发明的心血管治疗药培哚普利，用于治疗原发性高血压与心力衰竭，作用时间长，副作用小，耐受性好，市场前景良好。这些具有心血管疾病治疗功效的活性组中，普遍含有(S)-吲哚啉-2-甲酸或其加氢产物的特征结构。

目前，文献报道的合成(S)-吲哚啉-2-甲酸主要是用具有旋光性的起始原料合成、手性助剂合成法、化学试剂拆分法。如浙江大学的钱超以L-苯丙氨酸为“手性源”，经硝化、溴化、分子内环合制备得到了6-硝基-(S)-吲哚啉-2-甲酸，该产物可通过硝基还原、重氮化和去重氮基反应制备得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。其路线如下：

Vincent等以吲哚-2-甲酸为原料，经酯化、锡/氯化氢还原得外消旋吲哚啉-2-甲酸乙酯，再用(R)-α-苯乙胺为拆分试剂对其进行拆分，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。化学合成或拆分法均存在步骤繁多，污染严重或者拆分试剂价格昂贵的缺点。采用酶法制备是趋势，具有成本低，低排放的优势。

De Vries等的专利报道了以邻卤(氯或溴)苯甲醛为原料，与醋酐缩合，所得的肉桂酸衍生物用苯丙氨酸氨解酶(从Rhodosporidium toruloides ATCC 10788中获得)氨解得到光学纯的邻卤-L-苯丙氨酸，然后再经环合反应得到光学纯的(S)-吲哚啉-2-甲酸。

韩国SK公司专利报道使用外消旋的吲哚啉-2-甲酸甲酯作为底物，以商品化的Savinase作为催化剂水解，特异性水解(R)-吲哚啉-2-甲酸甲酯，再将不水解的(S)-吲哚啉-2-甲酸甲酯进一步水解，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸e.e.值达99％，收率47％。

对于拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在生物法拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用奠定良好的基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性酯酶、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用，解决了用野生菌B8W22制备(S)-吲哚啉-2-甲酸过程中的ee.值达不到93％以上的技术难题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种立体选择性重组酯酶，所述重组酯酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

MET Pro Leu Asp Pro His Ile Gln Ile Phe Leu Asn Gln Tyr Asn Glu METPro Arg Pro Ser Leu Glu Asp Val Thr Pro Pro Gln Leu Arg Glu MET Glu Lys METSer Leu Thr Pro