[发明专利]一种高保真CRISPR/AsCpf1突变体的构建及其应用

说明书

本发明公开了一种高保真CRISPR/AsCpf1突变体的构建及其应用。所述AsCpf1突变体为对AsCpf1蛋白氨基酸序列的第951位精氨酸和/或第955位精氨酸进行突变，替换成不与靶位点DNA之间形成氢键的氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1‑3所示。所述的AsCpf1突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。所述的编码基因在构建CRISPR/AsCpf1基因编辑系统中的应用。一种CRISPR/AsCpf1基因编辑系统，含有编码AsCpf1蛋白的基因，所述AsCpf1蛋白为上述所述的AsCpf1突变体。CRISPR/AsCpf1基因编辑系统在基因编辑中降低脱靶效应中的应用。本发明构建的新型AsCpf1突变体既保留野生型AsCpf1的基因编辑效率，同时比野生型AsCpf1具有较高的特异性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高保真CRISPR/AsCpf1突变体的构建及其应用。

背景技术

CRISPR/Cpf1是与CRISPR/Cas9系统相似的DNA编辑技术，它与CRISPR/Cas9一样，属于二类CRISPR系统核酸内切酶。但是，和Cas9相比，Cpf1更小，结构也更简单，而且Cpf1还具有Cas9没有的一些特性，如Cpf1切割形成的是粘性末端，PAM区为TTTN，且自身具有自加工CrRNA能力等特点，使得Cpf1不但可以帮助弥补CRISPR/Cas9系统的一些缺陷，而且可能在某些方面的应用上，比CRISPR/Cas9更有优势。目前CRISPR系统应用广泛，特别是它们逐渐被应用于疾病的基因治疗及改善退行性病变等方面。虽然CRISPR系统可以对各种细胞、组织、器官等进行高效基因编辑，但它们也会在一些与靶位点序列相似的位置产生非靶向的切割，这就是所谓的“脱靶效应”。这些脱靶效应会引起一些不可预测的突变，这就使得，如果要将这些核酸酶应用于临床，则可能存在潜在风险。基于此，开发高保真的CRISPR系统就显得非常关键。目前对于高保真Cas9已经开发了好几个版本，例如eCas9，Cas9-HF，HypaCas9，evoCas9等等。而对于Cpf1来说，其目前开发的高保真版本则很少。所以，本发明专利基于点突变技术，通过一系列突变改造，找到了一个高效，且可以降低脱靶效应的新型Cpf1突变体。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新的，具有降低脱靶效应的AsCpf1突变体(AsCpf1-KA突变体)，即高保真的CRISPR/AsCpf1突变体。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为，一种AsCpf1突变体，所述AsCpf1突变体为对AsCpf1蛋白氨基酸序列的第951位精氨酸进行突变，替换成不与靶位点DNA之间形成氢键的氨基酸；

或所述AsCpf1突变体为对AsCpf1蛋白氨基酸序列的第955位精氨酸进行突变，替换成不与靶位点DNA之间形成氢键的氨基酸；

或所述AsCpf1突变体为对AsCpf1蛋白氨基酸序列的第951位精氨酸和第955位精氨酸进行突变，替换成不与靶位点DNA之间形成氢键的氨基酸。

进一步地，所述AsCpf1突变体为对AsCpf1蛋白氨基酸序列的第951位精氨酸和第955位精氨酸进行突变，替换成不与靶位点DNA之间形成氢键的氨基酸。

进一步地，所述AsCpf1突变体为AsCpf1蛋白氨基酸序列的第951位的精氨酸R变为赖氨酸K，所述AsCpf1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

或所述AsCpf1突变体为AsCpf1蛋白氨基酸序列的第955位的精氨酸R变为丙氨酸A，所述AsCpf1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

或所述AsCpf1突变体为AsCpf1蛋白氨基酸序列的第951位的精氨酸R变为赖氨酸K，以及第955位的精氨酸R变为丙氨酸A，所述AsCpf1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。