[发明专利]达氏鲟三个内参基因、引物开发及稳定性评价技术方法

权利要求书

1.一种基于转录组的准确、高效的真核生物基因鉴定方法，包括β肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和延伸因子1α三个达氏鲟内参基因，其特征在于，包括如下方法步骤：

步骤一，以丝瓜cDNA为模板、并以如下引物对进行高保真酶的PCR扩增反应得到三个达氏鲟内参基因，引物对为：

ACT正向引物5'-ATGGAAGACGAAATTGCCG-3'

ACT反向引物5'TTAGAAGCATTTACGGTGGACGA-3'

GAPDH正向引物5'-GAATCTCACTCAGACGAGGACTT-3'

GAPDH反向引物5'GGTGTGTGGTTTAAGTGATGTCA-3'

EF1-α正向引物5'-ATGGGAAAGGAAAAGACCCACATC-3'

EF1-α反向引物5'GGACAGTCCAGGGGATGGTGGTT-3'

步骤二，三个所述达氏鲟内参基因实时荧光定量引物的开发，以步骤一中达氏鲟内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物，实时荧光定量PCR引物对如下：

qACT正向引物5'-CTGTTTCAGCCATCCTTCTTG-3'

qACT反向引物5'TTGATTTTCATTGTGCTCGGT-3'

qGAPDH正向引物5'-TCAAATGGGGTGATGCTGGAG-3'

qGAPDH反向引物5'GCGGAGATGATGACACGCTTAG-3'

qEF1-α正向引物5'-GAAAGGAAAAGACCCACAT-3'

qEF1-α反向引物5'CCAGGCATACTTGAAGGAGC-3'

步骤三，通过标准曲线和熔解曲线评估三个达氏鲟内参基因引物的质量，

步骤四，使用但不限于geNorm，NormFinder和Bestkeeper软件评价三个达氏鲟内参基因在组织表达中的稳定性。

2.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确、高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中的高保真酶包括但不限于Pfu，Pfu和Ultra，也可使用高保真mix。

3.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确、高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中的PCR产物直接测序若存在不准确，可使用克隆到载体中进行测序。

4.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确、高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中设计的引物设计原则包括：扩增片段长度在110-210bp，上下游引物差异不超过1个碱基，扩增效率在90％-100％，R2大于或等于0.995。

5.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确、高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中的引物设计软件不仅限于Primer Premier5.0软件。