[发明专利]滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增NK细胞的方法

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增NK细胞的方法。本发明所提供的滋养层细胞株，为整合有外源基因的K562细胞，外源基因包括：用于表达IL‑15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4‑1BBL的基因片段，第一基因片段、第二基因片段和第三基因片段依次设置。将该滋养层细胞株应用于体外诱导扩增NK细胞，可极大地提升NK细胞的增殖倍数、纯度和细胞毒性。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增NK细胞的方法。

背景技术

NK细胞(自然杀伤细胞)，是机体重要的免疫细胞，其特异性分子标记为CD3^-CD16⁺CD56⁺，并具有主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)非限制性杀伤的特点。NK细胞是驻留在粘膜系统和淋巴结等机体抵御病原体感染和恶性肿瘤的第一道防线的重要免疫细胞，在感染和肿瘤发生早期起着重要的控制作用。NK细胞可以识别并清除肿瘤细胞，无需预先抗原致敏，其对肿瘤细胞的识别依赖于细胞表面活化性受体和抑制性受体之间的平衡。NK细胞识别肿瘤细胞后，可通过释放穿孔素和颗粒酶、诱导凋亡、诱导肿瘤坏死因子(TNF)家族分子的表达，亦可通过其表面CD16分子介导的抗体依赖性细胞毒性作用(Antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC)，迅速破坏肿瘤细胞。

当前绝大多数临床以及临床前研究中所使用的NK细胞来源于人自体外周血单个核细胞(PBMC)，然而，由于NK细胞在PBMC细胞中仅占5％-20％的比例，且NK细胞在体外的扩增能力远远低于T淋巴细胞，这限制了NK细胞在临床的大规模应用。因此，如何从PBMC诱导获得大量的高活性NK细胞成为其是否能成功应用于临床的关键。

目前，体外培养NK细胞的方法主要有以下2种：1)细胞因子组合法，例如采用IL-2、IL-15、IL-18、IL-21等细胞因子诱导NK细胞体外扩增，Torelli GF等利用IL-2、IL-15诱导培养人PBMC细胞，在第14天NK细胞群平均增殖了15.7±4.7倍，存活率为96±0.5％；2)滋养层细胞诱导培养法，例如采用基因修饰的K562细胞诱导NK细胞扩增，Baek HJ等利用构建的K562-mbIL15-41BBL滋养层细胞诱导培养人PBMC细胞，经过21天的体外培养，NK细胞增殖倍数达到980倍。据目前已有的研究显示，采用滋养层细胞诱导培养法在NK细胞扩增倍数和纯度上要优于细胞因子组合的扩增方案，但是，现有的滋养层细胞诱导培养法需要多次转染，操作繁琐，成功率低，仍需进一步改善。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种滋养层细胞株，以应用于体外诱导扩增NK细胞，从而提高NK细胞的扩增倍数和纯度。

本发明的另一目的在于提供上述滋养层细胞株的制备方法，又一目的在于提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下具体技术方案：

一种滋养层细胞株，为整合有外源基因的K562细胞，所述外源基因包括：用于表达IL-15的第一基因片段、用于表达自剪切多肽P2A的第二基因片段和用于表达4-1BBL的基因片段，所述第一基因片段、所述第二基因片段和所述第三基因片段依次设置。

本发明提供的滋养层细胞株，为整合有外源基因的K562细胞，该外源基因通过表达自剪切多肽P2A的第二基因片段将表达IL-15的第一基因片段和表达4-1BBL的基因片段连接起来，使得IL-15和4-1BBL两种蛋白能够被同时表达，共同发挥IL-15和4-1BBL的作用；而且，该外源基因在K562细胞内表达时，自剪切多肽P2A进行共转录自剪切，产生分别单独表达在K562细胞膜上的IL-15和4-1BBL两种蛋白，提高了IL-15和4-1BBL的跨膜表达效率。将该滋养层细胞株应用于体外诱导扩增NK细胞，可极大地提升NK细胞的增殖倍数、纯度和细胞毒性。