[发明专利]碱基编辑工具及其应用以及在真核细胞内进行宽窗口和无序列偏好性碱基编辑的方法

权利要求书

1.一种碱基编辑工具，其特征在于，该碱基编辑工具包括：

（1）多拷贝的GCN4与D10A-Cas9连接形成的GCN4-D10A蛋白；

（2）胞嘧啶脱氨酶AID与尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI连于单链抗体scFv形成的scFv-AID-UGI蛋白，或者

胞嘧啶脱氨酶AID、尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI和防止多聚化的热稳定性结构域GB1连于单链抗体scFv形成的scFv-AID-UGI-GB1蛋白；

所述GCN4的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述D10A-Cas9的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述胞嘧啶脱氨酶AID为全长胞嘧啶脱氨酶AIDfl，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述防止多聚化的热稳定性结构域GB1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，所述胞嘧啶脱氨酶AID为SEQ ID NO：4的优化版本hAID*Δ，所述优化版本hAID*Δ为在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列进行K10E、E156G和T82I中的突变且缺失182-198位氨基酸的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的碱基编辑工具，所述优化版本hAID*Δ的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示。

4.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，其中，所述GCN4-D10A蛋白中，GCN4的拷贝数为8-12个。

5.根据权利要求4所述的碱基编辑工具，多拷贝的GCN4与D10A-Cas9通过连接子连接形成GCN4-D10A蛋白。

6.根据权利要求5所述的碱基编辑工具，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的碱基编辑工具，其中，所述碱基编辑工具还包括sgRNA载体，用于引导GCN4-D10A蛋白招募的scFv-AID-UGI蛋白或scFv-AID-UGI-GB1蛋白在靶位点进行碱基编辑。

8.根据权利要求7所述的碱基编辑工具，所述sgRNA载体为靶向富含GC的基因调控区或调控元件的sgRNA载体。

9.根据权利要求7所述的碱基编辑工具，所述sgRNA载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

10.编码权利要求1-9中任意一项所述的碱基编辑工具的核酸，其特征在于，该核酸包括：

（1）编码所述GCN4-D10A蛋白的第一核酸；

（2）编码所述scFv-AID-UGI蛋白或scFv-AID-UGI-GB1蛋白的第二核酸。

11.权利要求1-9中任意一项所述的碱基编辑工具或权利要求10所述的核酸在碱基编辑中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述碱基编辑在真核生物细胞中进行。

13.根据权利要求12所述的应用，所述的应用包括：用于引入提前的终止密码子进行基因敲除、用于产生随机突变实现蛋白进化、药物靶点筛选、基因调控元件筛选和富含GC的非编码区域功能研究中的至少一种。

14.一种在真核细胞内进行碱基编辑的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1-9中任意一项所述的碱基编辑工具引入真核细胞内，对靶位点进行碱基编辑。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述引入的方式包括：

（1）使用权利要求10所述的核酸转化真核细胞，获得转基因细胞；

（2）培养所述转基因细胞，使所述核酸表达以产生权利要求1-9中任意一项所述的碱基编辑工具。