[发明专利]一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺

说明书

本发明公开了一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，包括如下步骤：S1、进行土壤和气体分析，培养甲烷菌；S2、检测单不饱和脂肪酸异戊烯基侧链的碳氢化合物表示的乙酸分解的存在；S3、从土壤中提取DNA；S4、实时定量PCR和克隆库的分析甲基辅酶M还原酶；S5、mcrA基因的克隆和测序后进行统计分析，本发明结构科学合理，使用安全方便，在提取前，对于甲烷菌进行培育，通过土壤下压，从而排出土壤中的空气，提高其无氧效果，让甲烷菌的产量与数量均可以得到保障，而通过10‑22度，是甲烷菌最适合繁殖的温度，从而提高了其自身繁殖速率，并且通过有机肥增加其繁殖的肥料，而在提取其DNA后进行分析，检测甲基辅酶M还原酶的活性。

技术领域

本发明涉及甲基辅酶M还原酶提取技术领域，具体为一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺。

背景技术

甲烷菌属于原核生物，是专性严格厌氧菌、生长繁殖特别缓慢、培养分离比较困难，产甲烷菌不能在有氧气处生存，因此它们只能在完全缺乏氧气的环境中被发现，只有产甲烷和发酵作用能够在只有含碳化合物作为电子受体的情况下发生，产甲烷作用对人类也有用处。通过产甲烷作用，有机废物可以转化成有用的甲烷(“沼气”)。产甲烷作用同样在人和动物的肠道中发生。

但是目前市场上的甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取前，不能很好的增加甲烷菌的产量与后期的甲基辅酶M还原酶活性，并且在后期检测中，不能便于提取甲基辅酶M还原酶，由于样品产量大，测量的成本增大，而不能便于对于甲基辅酶M还原酶的DNA进行检测，无法检测其活性的问题。

发明内容

本发明提供一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，可以有效解决上述背景技术中提出目前市场上的甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取前，不能很好的增加甲烷菌的产量与后期的甲基辅酶M还原酶活性，并且在后期检测中，不能便于提取甲基辅酶M还原酶，由于样品产量大，测量的成本增大，而不能便于对于甲基辅酶M还原酶的DNA进行检测，无法检测其活性的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，包括如下步骤：

S1、进行土壤和气体分析，培养甲烷菌；

S2、检测单不饱和脂肪酸异戊烯基侧链的碳氢化合物表示的乙酸分解的存在；

S3、从土壤中提取DNA；

S4、实时定量PCR和克隆库的分析甲基辅酶M还原酶；

S5、mcrA基因的克隆和测序后进行统计分析。

根据上述技术方案，所述步骤S1中对于甲烷菌进行培育，甲烷菌是在厌氧环境发酵，在有机培养池中，填入土壤后加入有机物，接着加入有机肥，接着继续填充土壤覆盖住有机物，下压土壤，排出土壤中的空气，增强反硝化率，并且刺激微生物代谢，保持有机培养池温度在10-22度，检测甲烷菌数量与活性。

根据上述技术方案，所述步骤S1中有机物为秸秆、牛粪便和河湖淤泥，所述秸秆、牛粪便和有机肥重量比例为2:1:1:0.5。

根据上述技术方案，所述步骤S1中土壤中含量为60-80％砂，14-32％淤泥和6-14％粘土。

根据上述技术方案，所述步骤S3中通过1000mg土壤中提取DNA，提取物的数量和质量采用分光光度法测定。

根据上述技术方案，所述步骤S5中在ABIPRISM7700序列检测系统进行，反应混合物含有5毫升的ROX，1.5毫克牛血清蛋白、5％二甲基亚砜、0.5毫升的DNA模板和水的最终体积25毫升。

根据上述技术方案，所述步骤S4中具体操作步骤如下：

A1、由初始951度变性15min和941度变性1min4放大到在721度和521度各1分钟；