[发明专利]一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：1)构建LT基因同源重组供体LT donar，LT donar的碱基序列依次包括L‑arm、cat promoter、CmR、sgCommon、PAM、L‑short、R‑arm多核苷酸片段；以及2)制备含pCas‑Red质粒的感受态细胞，加入步骤1)的LT donar进行转化，然后筛选阳性克隆，即得无痕敲除了热不稳定肠毒素基因LT的大肠杆菌。本发明将Crispr/Cas9与λ‑Red同源重组系统结合，成功地对产肠毒大肠杆菌K88的LT基因进行无痕敲除，突变菌株丧失溶血能力，减缓生长；利用本发明的方法可快速、便捷的对产肠毒大肠杆菌K88基因进行无痕敲除，为研究LT功能提供了坚实的研究基础。

技术领域

本发明涉及基因敲除技术领域，尤其是一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌及其构建方法。

背景技术

肠毒素是ETEC分泌的一种毒性蛋白，常见的有热不稳定肠毒素(heat-labiletoxin,LT)与热稳定性肠毒素(stable toxin,ST)两类，它们是此类导致腹泻的主要因子。由于猪感染产肠毒大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)后的发病率和死亡率极高，尤其是在断奶后仔猪中，给养殖业带来巨大损失。LT对热较为敏感，65℃以上温度加热30min可使其失活。但是，LT具有较强的免疫原性，可提高产肠毒大肠杆菌和其他病原体与肠上皮胞的粘附性，因此毒性很强^[1]。产肠毒大肠杆菌的LT有两个亚基，A亚基和B亚基，每个亚基单独存在是没有活性，但是结合起来则形成毒性蛋白。A亚基是毒性中心，B亚基具有免疫原性。 LT通过B亚基与肠上皮细胞表面的GM-1神经节苷脂结合，产生毒素，并释放有生物活性的A亚基从而发挥其毒性^[2]。鉴于肠毒素基因的重要作用，研究其致病机制，减少畜禽腹泻的发生，构建其突变菌株有着重要意义。

目前，常见的基因敲除体统有Red和Crispr/Cas9系统。Red系统能够促进有限同源区(约50bp)的线性DNA与大肠杆菌染色体的重组。Red重组系统属于λ-噬菌体重组体系，其编码基因包括exo、bet和gam以及控制他们的P_L操纵子。 exo基因编码的λ核酸外切酶负责将dsDNA 5’端切开、产生3’端缺口，bet基因编码的β蛋白与RecA等其他因子一起引导断裂DNA入侵dsDNA，gam编码的 Gam蛋白主要起到稳定DNA的作用，抑制宿主的RecBCD蛋白的核酸外切酶活性，保证用于重组的外源的线性DNA的稳定性。Crispr/Cas9系统发现于细菌的免疫系统，它有助于菌体抵抗外源DNA的侵染，对其进行精准、有效的切除^[3,4]。 CRISPR/Cas9使用单个DNA内切酶Cas9来识别dsDNA底物，并利用不同的核酸酶结构域(HNH或RuvC)对每条链进行裂解，HNH切割向导RNA(sgRNA) 识别的靶DNA的互补链，RuvC切割靶DNA上不与sgRNA作用的非互补部分。其基因敲除的基本过程为：(1)反式激活crRNA(tracrRNA)的非编码小RNA 与crRNA中的重复序列碱基配对，形成双RNA杂合结构。(2)由双RNA杂合结构指导Cas9切割与crRNA上sgRNA互补的目标DNA，产生位点特异性的平末端双链断裂(DSB)。(3)通过非同源末端连接修复，导致切割位点上小的随机插入和/或缺失(indels)，或通过同源重组修复，使用同源修复模板在DSB位点上进行精确的基因组修饰^[5,6]。目前Crispr/Cas9系统已经在动、植物及微生物中已得到广泛地应用^[7-9]。

细菌的基因组敲除，特别是大肠杆菌通常使用λ-Red系统，其优点是对细菌敲除效率较高，缺点是实现无痕敲除步骤较为繁琐，会留下FRT的标记。 Crispr/Cas9的优点是易于实现无痕敲除，但是对前间区序列邻近基序(PAM序列) 依赖程度较高，而且对一些细菌的敲除效率不高。

发明内容