[发明专利]一种适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法

说明书

本发明公开了一种适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法，包括：制备液体凝胶、制备细胞载具、拉针、细胞排布、注射针预处理及显微注射。利用该方法可将外源基因或蛋白导入卵细胞中，提高了外源物质的导入阳性率。

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，更具体地说是涉及一种适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法。

背景技术

细胞作为生物体基本的组成单元和功能单元，是显微操作常见的研究对象。20世纪70年代，DNA重组技术等基因工程试验手段为动物转基因技术的产生奠定了基础。近50年来，随着模式生物转基因技术研究的不断深入，越来越多的新方法被发明出来，例如显微注射法、电穿孔技术、逆转录病毒载体法、脂质体转染技术、精子载体法、体细胞核移植法等。

我国已跨越进入海洋生物基因组领域的国际前沿，然而，以基因编辑技术为核心的功能基因验证技术是制约后基因组时代深度开发和利用海洋生物基因资源的瓶颈。目前的贝类转基因研究中，利用化学或物理方法将外源基因导入细胞的方法：如电穿孔、精子载体法等，多存在转染效率较低的问题。病毒介导的转基因方法广泛应用于哺乳动物，特别是人和小鼠的细胞，但由于缺乏合适的病毒介导外源基因导入贝类等海洋生物细胞，制约了这一方法海洋生物基因编辑研究领域的应用。体细胞核移植法首先需要将目标基因转移到体外培育的体细胞中，然而，贝类的体外细胞培养技术一直未取得明显突破，因而无法进行阳性转基因体细胞的培养及筛选，且该技术操作程序复杂，对设备及技术要求较高，不适用于高繁殖力的贝类软体动物。

在显微镜视野内利用微注射针将外源物质引入单个细胞的显微注射技术已成为现代生物细胞工程及发育生物学研究的重要试验技术手段之一，尤其是转基因研究领域。与其他转基因技术相比，显微注射技术具备注射样品多样化，注射微量且定量、高效稳定、注射基因大小不受限制、无需载体等优点，在物种改良、细胞内核质研究及免疫学领域中得到广泛应用。因此，显微注射技术的广适用性使其有望成为海洋生物细胞工程及基因功能研究领域的重要工具。然而，由于双壳贝类等海洋生物卵细胞较小，多在微米级别，这也为研究者带来了一定的挑战，例如细胞载具的制备，注射针的硬度及拉制参数的选定等。

因此，如何提供一种适宜的显微注射方法并以此提高贝类软体动物卵的外源物质导入效率是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种规范化、操作简单且高效稳定的适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法，利用显微注射的方法，将外源物质导入卵细胞中，提高了外源基因的阳性率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法，包括下述步骤：

1)制备液体凝胶；

2)制备细胞载具：取洁净的盖玻片，先以具备与卵径相匹配直径的金属丝沿其宽度方向缠绕5圈，再将缠绕金属丝的盖玻片轻覆于步骤1)中的液体凝胶表面，使液体凝胶浸没盖玻片底面，待液体凝胶凝固后，将缠绕金属丝的盖玻片取下，得到细胞载具，备用；

3)拉针：对排布针及注射针进行系统拉针；

4)细胞排布：先将步骤3)所得排布针的针尖切除4-5mm，再以切除针尖后的排布针将卵细胞均匀排布于细胞载具内，并以海水覆盖整个细胞载具；

5)注射针预处理：先向注射针内加入外源基因溶液；然后切除注射针针尖20μm，备用；

6)显微注射：将细胞载具置于倒置显微镜载物台上，调节注射针与注射针操作臂的夹角，直至注射针与细胞载具所在平面的夹角呈30°，然后以微量显微注射仪对卵细胞进行显微注射。

以上技术方案达到的技术效果是：通过制备细胞载具、拉针、细胞排布及显微注射的一系列过程，显著提高了外源基因的导入率。

作为本发明优选的技术方案，步骤1)中液体凝胶的制备过程如下：