[发明专利]一种L-草铵膦或其盐的生产方法

说明书

本发明公开一种去消旋化制备L‑草铵膦的酶催化工艺。其特征为，通过外加的过氧化氢在过氧化氢酶作用下原位生成并溶解的氧来作为氧源；以DL‑草铵膦为原料，在D‑氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和合适的辅酶循环体系催化下实现DL‑草铵膦的去消旋化；通过这种原位供氧的工艺，可以显著缩短反应时间，显著提高产物浓度。

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种L-草铵膦或其盐的生产方法；具体地是一种利用酶催化反应将DL-草铵膦去消旋化生成L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦(glufosinate,4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸)是世界销量第二的转基因作物耐受除草剂。它是一种广谱触杀型除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内的L-谷氨酰胺合成酶的活性，导致植物体内氮代谢紊乱，最终死亡。与草甘膦相比，草铵膦实用性广、见效快，持效期长，具有更低毒、安全等显著优势。因此，草铵膦的销量增长迅速，在未来一段时间内市场需求巨大，前景非常广阔。

但是，由于草铵膦的工艺路线复杂，产品生产技术难度较高，居高不下的价格成为其迅速取代草甘膦的障碍。目前市售的草铵膦是含等量的两种光学异构体的外消旋混合物(DL-草铵膦)，但其中只有L-构型具有生理活性。如果可以将DL-草铵膦高效而专一的去消旋化生成L-草铵膦，并使无用的D-草铵膦转变成有活性的L-草铵膦，那么在不改变现有草铵膦生产路线和产能的基础上，可提高近一倍除草活性。因此，DL-草铵膦去消旋化制备手性纯L-草铵膦具有重要现实意义，成为近年来合成L-草铵膦的热门方向。

近年来报道从DL-草铵膦制备L-草铵膦的方法众多。传统的化学修饰拆分法因成本高、且不能利用D-型草铵膦而不具备竞争性。目前报道的几种将其中的D-草铵膦转化成为L-草铵膦的方式主要有下列代表性路线：

1.N-酰基化后水解酶选择性拆分。

中国专利申请CN108690854A中，DL-草铵膦被制备成N-乙酰基草铵膦，而后者经羧肽酶的水解作用，可以选择性获得L-草铵膦；其中的D型底物不参与水解，可经化学或酶法消旋化后能再次循环进入水解步骤。该方法的缺点是需多步反应，还有需从N-酰基底物中分离水解后的L-草铵膦。

2.将D-草铵膦氧化成2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)后，再对该中间体还原或转氨生成L-草铵膦。大部分文献中，将D-草铵膦转化成PPO的步骤是D-氨基酸氧化酶(DAAO)催化的氧化过程，往往还要添加过氧化氢酶(CAT)移除生成的过氧化氢。

在中国专利申请CN105567780A中，消旋体中的D-草铵膦在DAAO作用下被氧气氧化生成PPO，然后PPO在钯碳催化下被甲酸还原生成DL-草铵膦，如此往复，利用DAAO的立体选择性，将DL-草铵膦逐渐转化为L－草铵膦。这个方案优点是一锅反应，转化率高时无需额外分离。但是，缺点是钯碳催化剂用量大，无立体选择性差别的还原反应浪费反应原料(氧气和甲酸铵)。

在美国专利申请US20180030487A1中，D-草铵膦到PPO的转化采用的是一样的方法，后一步则采用了L-氨基酸转氨酶(L-TA)催化的立体选择性转氨反应将PPO转化成L-草铵膦。这种方法的缺点也比较明显，转氨步骤是平衡反应，需要提供过量的氨基供体(氨基酸或有机胺)来保证较高的转化率(3倍当量氨基给体，90％转化率)，而这些过量的氨基供体和对应的副产物将严重影响后续的分离纯化步骤。

中国专利申请CN107502647A中，从PPO到L－草铵膦转化的方式是L－氨基酸脱氢酶(L-AADH)催化的立体选择性还原反应。该专利申请使用甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、酮还原酶等多种辅因子循环体系，实现了20mM消旋底物的去消旋化。这种方案中，第二步反应并非平衡，并不需要大大过量的氢给体,但是转化浓度却比较低。在类似的中国专利申请CN109576236A中，消旋底物浓度也只有50mM。另有中国专利申请CN109609582A中，使用表达了上述功能蛋白的菌体为催化剂，实现了较高浓度底物(200mM)的转化，但是过程损失比较大(约17％)。