[发明专利]一种提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法

说明书

本发明公开了提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法，属于生物技术领域。本发明通过提取微量蝰蛇组织及其毒素中基因，分别使用不同引物对作为特异性引物，获得PCR扩增产物，随后通过琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经测序后为蝰蛇特异性基因序列。本发明的检测方法具有特异性高，稳定性好，检测迅速，易于操作等优点，有利于规模化和自动化检测分析，是快速、特异的鉴别蝰蛇及其毒素的一种方法。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及国内常见毒蛇之一蝰蛇及其毒素微量基因提取及其检测方法。

背景技术

毒蛇伤害是一个全球性的公共卫生问题，可导致呼吸麻痹、致命性出血性败血症、不可逆性肾功能衰竭和导致永久性残疾的局部组织严重坏死。

圆斑蝰蛇，属蝰亚科蝰属，在我国主要分布于福建、广东、广西等地（赵尔宓．中国蛇类[M].合肥:安徽科学技术出版社,2006.148-149.），系血液毒类毒蛇，为中国十大毒蛇之一。圆斑蝰蛇咬伤后早期可导致严重的凝血功能障碍，易发生弥散性血管内凝血，颅内或内脏出血等并发症（张跃,唐荣德,李景新,et al.蝰蛇咬伤治疗期间肾功能指标动态变化分析[J].蛇志,2012,24(3).）。圆斑蝰蛇致死率为9.23%，仅次于眼睛王蛇和银环蛇（吴远冰,姚先明,伍侣新.抗蝰蛇毒血清治疗蝰蛇咬伤72例报告[J].蛇志,1996(2):43-45.）。

抗蛇毒血清是目前国内常用的治疗毒蛇咬伤的特效药物，目前我国常见的抗蛇毒血清包括抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗眼镜蛇毒血清等。但是在应用抗蛇毒血清治疗蛇伤之前必须根据肇事毒蛇种类选择正确种类的抗蛇毒血清，才能降低过敏反应的风险，提高毒素拮抗效率获得理想的疗效，否则将导致血清病等严重过敏反应的发生，错失救治的最佳时间。目前我国蛇伤临床诊断主要依靠病史和临床表现，缺乏快速、特异的实验室鉴别蛇毒种类的方法，往往造成治疗的盲目性。此前国内外尚未公布蝰蛇的全基因组序列，尚未见从样品尤其蛇毒中提取DNA 并扩增出靶标序列的特异性引物和方法。因此，本发明利用现代分子生物学技术，开发一种操作简单，快速鉴别，灵敏度高，特异性好的检测方法尤其重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种提取微量蝰蛇基因的方法。

本发明要解决的技术问题之二在于提供一种检测蝰蛇毒的PCR方法，该方法利用PCR技术使用特异性的引物扩增目的基因来鉴别蝰蛇及蝰蛇毒，本方法可以检测出来自样品的微量DNA，具有检测灵敏度高，方法快速，易操作的优点。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

在本发明的一方面，提供一种微量基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：

步骤1，取适量圆斑蝰蛇组织或蝰蛇毒作为样品，置于离心管内，加入适量纯水及终浓度为100μg/ml的蛋白酶K，37℃孵育，离心；

步骤2，吸上清置于另一离心管内，随后加入等体积平衡酚，混匀，离心；

步骤3，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积1：1混合平衡酚：氯仿，随后混匀，离心；

步骤4，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积氯仿，混匀，离心；

步骤5，吸上清水相于另一离心管，加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上，离心；

步骤6，丢弃上清，室温凉干，加入纯水，室温溶解，备用。

作为本发明优选的技术方案，步骤1-步骤5中，所述离心的条件是12000g离心10min。

在本发明的另一方面，提供一种检测蝰蛇毒的PCR方法，包括如下步骤：

第一步，设计PCR引物序列和组合如下；