[发明专利]一种高效芳香烃双加氧酶分子的改造方法

说明书

本发明提供了一种高效芳香烃双加氧酶分子的改造方法，该方法包括：一种芳香烃双加氧酶的分子改造方法，该方法包括：确定NDO酶催化活性区域周围氨基酸残基；分析氨基酸残基的亲水性和/或疏水性，将N亲水性氨基酸残基替代为疏水性氨基酸残基，得到改造的NDO酶并验证其结构合理性；判断改造的NDO酶与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘结合亲和性；计算改造的NDO酶与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘分子降解反应的反应能垒(ΔE)及降解反应的速率常数(k)；筛选出与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘分子的亲和性升高、ΔE降低以及k增大的改造的NDO酶。本发明方法操作简便、计算快速、容易实现，可筛选出芳香烃的高效降解酶。

技术领域

本发明是关于一种高效芳香烃双加氧酶(NDO酶)的分子改造方法，属于芳香烃生物降解技术领域。

背景技术

随着我国经济建设的发展，人们对石油的需求量日益增加，但在石油开采、储存、运输和加工过程中，大量石油烃进入土壤，造成了严重的环境污染。土壤石油污染会破坏土壤的有机质组成和结构，阻碍植物根系的呼吸及对营养的吸收，导致植物生长不良甚至死亡。石油中的有害物质通过食物链进入人体，直接危害人体健康。芳香烃是石油中最常见且难降解的一类有机污染物，且部分芳香烃类物质具有致癌、致畸、致突变等作用。

土壤石油污染修复技术可分为原位修复和异位修复两大类，其修复方法主要包括物理修复方法、化学修复方法、植物修复方法和微生物修复方法。其中，微生物修复法通过利用土壤-微生物-污染物系统所自有的物理、化学和生物过程，使石油类污染物在微生物的新陈代谢循环中得到转化和去除，并可以在人为干预下，使土壤中的微生物群落和理化条件朝有利于提高污染土壤微生物活性的方向进行。微生物修复法由于具有处理成本低、修复效果好、无二次污染、对环境影响小等优点，已成为土壤石油污染修复的重要技术。

目前，关于芳香烃微生物降解的研究已较为深入，已有研究表明芳香烃双加氧酶(NDO酶)是芳香烃降解过程中的代谢关键酶，NDO酶控制苯环加氧，是微生物降解反应的限速步骤，决定了芳香烃整个降解过程的效率。国内外对NDO酶的研究大多集中在菌株筛选、酶的分离纯化、酶的结构表征等方面，相关研究例如“难降解芳香烃生物降解及基因工程菌研究进展[J].”(杜翠红,周集体,王竞,等，环境科学与技术，2005,28(1):106-108)。而关于NDO酶结构、功能及其分子生物学改造的研究相对较少。因此，设计和开发新型NDO酶以提高微生物对芳香烃的降解速率，对于今后石油污染土壤中芳香烃的高效降解及其代谢关键酶改造具有重要的科学价值和现实意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种NDO酶分子改造方法，以筛选出实现土壤中芳香烃类物质的高效降解的改造的NDO酶。

一方面，本发明提供了一种芳香烃双加氧酶的分子改造方法，该方法包括：

确定NDO酶催化活性区域周围氨基酸残基；

将NDO酶分别与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘分子进行分子对接，确定上述氨基酸残基中NDO酶与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘分子发生直接相互作用的关键氨基酸残基；

分析上述关键氨基酸残基的亲水性和/或疏水性，将NDO酶活性位点处的亲水性氨基酸残基替代为疏水性氨基酸残基，得到改造的NDO酶并验证其结构合理性；

判断改造的NDO酶与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘之间的结合亲和性；计算改造的NDO酶与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘分子降解反应的反应能垒(ΔE)；计算在298K条件下改造的NDO酶与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘降解反应的速率常数(k)；筛选出与芳香烃萘、蒽、芘和苯并[a]芘分子的亲和性升高、ΔE降低以及k增大的改造的NDO酶。