[发明专利]对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法

说明书

本发明公开了一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，该方法包含：获得原代猪扁桃体细胞，并进行培养；以pHY‑sv40‑Puro作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV‑VSV‑G作为辅助包装载体，共同转染进入293T细胞中，获得慢病毒颗粒；将慢病毒颗粒感染经培养后的原代猪扁桃体细胞系；经过感染后，将猪扁桃体细胞在含血清的DMEM/F12培养液中添加嘌呤霉素进行细胞筛选，获得阳性细胞；将阳性细胞用不含嘌呤霉素的培养液扩大培养，得到扁桃体上皮细胞传代细胞系。本发明的方法以猪扁桃体细胞作为宿主细胞，通过感染的方法得到JEV易感的猪扁桃体细胞系，该细胞系对JEV敏感，可以用于相关研究。

技术领域

本发明涉及一种猪扁桃体细胞系的构建方法，具体涉及一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法。

背景技术

猪日本乙型脑炎(简称为乙脑)是由猪流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)引起的常见病毒性脑炎，是一种人兽共患传染病，多种家畜、禽类以及人类都能够感染该病。该病主要经由蚊虫等吸血昆虫的叮咬以传播病毒，任何品种和性别的猪对该病均具有易感性。临床症状主要为妊娠母猪发生流产或是产死胎，初生仔猪脑炎、共济失调、发热、死亡，公猪睾丸明显肿大，个别病猪可能出现神经症状，有些孕畜也会被感染流产。

PK-15细胞(猪肾上皮细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞)、PIEC细胞(猪髋动脉内皮细胞)等均是研究猪乙脑病毒感染常用的细胞系，但这些细胞的来源器官本身不感染或很少感染猪病毒，使用PK-15、ST、PIEC等细胞来研究猪乙脑病毒感染过程存在感染增殖不同于靶器官、先天性免疫应答不同于靶器官、获得性免疫应答不同于靶器官、病毒和细胞相互作用不同于靶器官等情况。这些病毒和基因的变化以及相互作用与靶器官的实际情况并不完全一致，甚至是完全不一样的，这种结果很可能会造成误导，导致实验结果和临床实际情况不一样，会影响临床的疫苗和药物开发。

猪扁桃体是猪多种疾病的靶器官，也是发生体内感染的病灶。但是目前没有可用的猪扁桃体细胞系用于研究猪扁桃体对猪病感染和传播的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，该方法解决了现有方法没有构建对猪病毒感染的猪扁桃体细胞系的问题，以猪扁桃体细胞作为宿主细胞，具有无限传代的功能，且对JEV敏感，可以用于JEV的传代以及相关的研究。

为了达到上述目的，本发明提供了一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，该方法包含：获得原代猪扁桃体细胞，并在5％FBS的DMEM/F12培养基中进行培养，该培养基中添加100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素；以pHY-sv40-Puro作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，共同转染进入293T细胞中，获得含有慢病毒载体pHY-SV40-Puro的慢病毒颗粒，并采用2％FBS的DMEM培养；将所述慢病毒颗粒感染经培养后的原代猪扁桃体细胞系；经过所述感染后，将猪扁桃体细胞在含血清的DMEM/F12培养液中并添加嘌呤霉素进行细胞筛选，该嘌呤霉素的浓度为其对正常猪扁桃体细胞的最小致死浓度，获得阳性细胞；将所述阳性细胞用不含嘌呤霉素的5％FBS的DMEM/F12培养基扩大培养，构建得到对JEV易感的猪扁桃体细胞系。

优选地，所述原代猪扁桃体细胞的制备包含：将所需的猪扁桃体部位于无菌平皿内，去除结缔组织，用Hank's液洗涤，剪碎，加入Hank's液，移入无菌三角烧瓶内，使细胞分散，静止，收集上层细胞悬液。

优选地，所述慢病毒颗粒的制备包含：将经所述转染的293T细胞培养，待标记基因EGFP表达，第一次收集上清液，再培养一段时间，收获上清液和细胞，并与前述第一次收集的上清液混合；反复冻融使细胞破裂，过滤，收集上清液，将该上清液与PEG8000混合，获得沉淀并用DMEM培养液溶解，获得所述慢病毒颗粒。

优选地，所述感染时，加入凝聚胺。