[发明专利]CRISPR/Sa-SauriCas9基因编辑系统及其应用

说明书

本发明属于基因编辑技术领域，具体为一种CRISPR/Sa‑SauriCas9基因编辑系统以及其应用。本发明基因编辑系统为Sa‑SauriCas9蛋白与sgRNA形成的复合体，能精确靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑；Sa‑SauriCas9为融合蛋白，把SaCas9的PAM识别结构域（PAM interacting，PI）替换为SauriCas9的PAM识别结构域（SauriCas9‑PI）。Sa‑SauriCas9蛋白小，为1056个氨基酸，识别的PAM序列简单，所述Sa‑SauriCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种能在细胞中进行基因编辑的CRISPR/Sa-SauriCas9系统以及其相关应用。

背景技术

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统。在CRISPR/Cas9系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)、tracrRNA(trans-activating RNA) 以及Cas9蛋白形成复合体后，识别靶位点的PAM(Protospacer AdjacentMotif)序列，crRNA 会与靶DNA序列形成互补结构，Cas9蛋白行使切割DNA的功能，使DNA发生断裂损伤。其中， tracrRNA和crRNA通过连接序列可以融合成为单链指导RNA(singleguide RNA，sgRNA)。当 DNA发生断裂损伤后，细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复：非同源末端连接 (Non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重组(homologousrecombination,HR)。NHEJ 修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，利用 HR修复可以进行基因的定点插入和碱基的精确替换。

除了基础科研外，CRISPR/Cas9还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas9系统做基因治疗时，需要把Cas9和sgRNA导入到体内。目前做基因治疗最有效的递送载体是AAV病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb。SpCas9因为PAM序列简单(识别NGG)和活性高而得到广泛应用。但是SpCas9蛋白有1367个氨基酸，加上sgRNA和启动子，无法有效的包装到AAV病毒中，限制了其在临床中的应用。为了克服这个问题，几个小的Cas9被发明出来了，包括SaCas9(PAM序列为NNGRRT)；St1Cas9(PAM序列为NNAGAW)；NmCas9(PAM序列为NNNNGATT)； Nme2Cas9(PAM序列为NNNNCC)；CjCas9(PAM序列为NNNNRYAC)，但是这些Cas9或者PAM序列复杂(在基因组中可靶向的DNA序列少)，或者编辑效率低，难以广泛应用。寻找Cas9蛋白小，PAM序列简单CRISPR/Cas9系统是解决上述问题的希望所在。

发明内容

针对上述问题，本发明目的在于提供一种编辑活性高、Cas9蛋白小、PAM序列简单的 CRISPR/Cas9新的基因编辑系统及其应用。