[发明专利]Polβ过表达质粒、细胞模型及其在抗卵巢衰老药物中的应用

说明书

本发明公开了Polβ过表达质粒、细胞模型及其在抗卵巢衰老药物中的应用。Polβ过表达质粒导入细胞或者将Polβ基因导入卵细胞中，可显著提高卵细胞抵御外界不良刺激，可以在制备抗卵巢衰老试剂或者药物中应用。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种Polβ过表达质粒、细胞模型及在抗卵巢衰老药物中的应用。

背景技术

研究表明，对于年龄介于30至35岁之间的女性，ART的怀孕率为50％。对于年龄在35到40岁之间的女性，怀孕率仅为30％。Belloc等人的一项研究。可以看出，ART目前并未完全代偿由年龄相关的生殖能力下降引起的不育症。

高龄导致的女性生殖能力下降以及胎儿染色体异常的增加是目前困扰女性生殖健康的最大挑战。女性生育能力下降与卵细胞质量的下降以及卵巢中卵泡数量的下降密切相关。在女婴刚出生时，其卵巢中卵细胞数量接近100万枚左右，但是在女性一生中，仅仅只有约500枚卵细胞排出，这只占卵泡池0.1％，而剩下的约99.9％卵细胞是白白损耗掉，并且这种损耗的机制不明。卵泡池损耗从女婴约1-3岁开始直到女性约51-52岁卵巢储备耗竭为止，是一种非线性的加速过程。如果我们能找到在女性生殖后期卵泡池加速耗竭的原因，然后靶向治疗，就能实现改善高龄女性生殖能力以及推迟更年期的目的。数字建模计算得出，如果能让卵泡池耗竭减速，更年期能够被推迟到约71岁。

在哺乳动物卵细胞中，同源重组修复在保护卵细胞的数量和质量方面起着重要作用。已有大量的研究表明，GV期卵细胞中DNA双链断裂修复缺陷是高龄导致卵巢储备耗竭的原因。DNA双链断裂(DSBs)是最严重的并且破坏遗传信息的完整性。由DNA损伤介导的毛细血管扩张性共济失调(ATM)通过同源重组机制调节DSB修复。BRCA1和BRCA2是ATM DSBrepair家族基因中重要的成员。BRCA1蛋白与RAD51蛋白协同作用，并在同源重组修复中起关键作用。同时，它也是与CHK2协同调控有丝分裂进程的蛋白。删除BRCA1将导致基因组不稳定，触发P53介导的细胞周期检查点。高龄中，参与DSB repair的BRCA1与ATM途径中其他关键基因表达量较年轻少。如果DNA损伤不能被修复，细胞将会通过凋亡和衰老而被淘汰，退出细胞周期，从而避免非常严重的突变影响。

同源重组修复在保护卵巢内卵细胞的数量和质量上起着重要作用。已有大量的研究表明，GV(Germinal Vesicle)期卵细胞中DNA双链断裂修复(Double Strand BreaksRepair,DSBR)缺陷是高龄导致卵巢储备耗竭的原因。同源重组发生在初级卵母细胞第一次减速分裂细线期，终止于双线期。此后卵细胞在卵巢中停留数十年，直至接受激素刺激，获得受精能力。在这漫长的数十年中，卵细胞要经历来自体内和体外的不良环境刺激。修复DNA损伤的能力对于维持卵巢中卵细胞数量是至关重要的。因此，如果卵细胞不能应对DNA损伤，它将导致胚胎染色体异常并将缺陷遗传给下一代。不同于先前大量研究聚焦在DNADSBR参与卵巢储备维持上，休眠期的卵细胞已处于双线期，此时已完成同源重组。此外，也有研究报道碱基切除修复(Base Excision Repair,BER)缺陷参与年龄相关的疾病发生。

人类首次从兔骨髓中纯化获得Polβ，其特征为小分子量DNA聚合酶，这为Polβ的系统研究拉开了帷幕。在哺乳动物中存在至少14种DNA聚合酶，根据它们的序列可变性将其分为A-，B-，RT-，X-和Y-五个家族。Polβ是在X家族中发现的第一种DNA聚合酶，该家族还包括Polλ、Polμ和末端转移酶(TdT)。Polβ蛋白是一个大小为39KD由335个氨基酸组成的聚合酶，具有5’-dRP裂合酶和聚合酶两个主要活力，它不具有核酸外切酶活性，并且在脊椎动物的整个生命过程中表达。Polβ具有小的分子量，被认为是细胞中最简单的DNA聚合酶。此外，Polβ可通过大肠杆菌表达纯化得到大量重组蛋白，这些特点使得它成为研究核苷酸转移酶及裂合酶反应机制的理想模型。