[发明专利]染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法

说明书

本发明提供了一种染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法，涉及生物技术领域，该检测方法包括通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型，通过第二检测单元鉴别待测样品是否为突变型，对第一检测单元的鉴别结果和第二检测单元的鉴别结果进行判读，判断待测样品是否有染色体长片段插入。本发明通过增设第二检测单元，并结合第一检测单元和第二检测单元的鉴别结果对染色体长片段插入进行检测，能够对长片段插入进行有效的检测，并且有效减少假阴性结果，同时还能够有效减少假阳性结果。此外，采用本发明提供的染色体长片段插入的检测方法，还具有拓宽待测样本类型的特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法。

背景技术

染色体较长片段的插入与疾病的发生和药物代谢差异有相关性。当靶序列中有较长片段的插入时，由于竞争或PCR偏好性等原因，在同一体系内实现共扩增时，含插入序列的较长片段(突变型)扩增效率低于不含插入序列的较短片段(野生型)。当样本类型为杂合子时，因2条链扩增效率差异不同，会导致杂合子不能检出含插入序列的较长片段误报为纯合野生型，出现假阴性。插入序列越长，模板DNA片段化越严重(如口腔脱落细胞片段化程高于外周血)，杂合子假阴性倾向越明显。分别检测野生型(无插入)和突变型(有插入)，特别是不检测插入序列全长而只检测其中一小段序列时，常因本底波动或样本间交叉污染出现假阳性，使得纯合野生型被误报为杂合子。样本检测量越多，插入序列检测片段越短，假阳性倾向越明显。应用广泛的NGS在长片段插入检测上也有明显短板：NGS单端测序有效片段长度为150bp，双端测序有效片段长度为300bp，均不能涵盖长片段插入。

染色体长片段插入常用的检测方法包括PCR-直接测序法、基因扩增- 单链构象多态分析(PCR-SSCP)、荧光定量PCR法、Gap PCR-电泳等多种方法，每种方法技术原理及优缺点见下：

1、PCR-直接测序法：也称PCR-Sanger测序，将引物设计在插入序列两侧翼，一对引物实现对插入/非插入链同时扩增，通过毛细管电泳分离这些片段后读取待测核酸的碱基序列。但毛细管电泳受毛吸管长度影响，每次测序长度不宜超过1kb；对于长片段插入需要进行拼接测序，对样本消耗大，且操作繁琐，判读复杂。

2、PCR-SSCP：设计一对引物，发生插入时，靶序列构象发生变化，引起泳动变位，通过显色或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别。优点是对DNA原始材料纯度要求不高且所需量较少，实验操作简便；缺点是假阴性比例高，对于大于300bp的DNA片段，随着DNA片段长度的增加，检测的敏感性逐渐降低，多用于定性。

3、荧光定量PCR法：分别针对插入/非插入设计不同荧光标记的2条探针和2套PCR引物。杂合子易出现假阴性判读为纯合子，纯合子又易因为样本污染或本底波动出现假阳性判读为杂合子。

4、Gap PCR-电泳：将引物设计在插入序列两侧翼，一对引物实现对插入/非插入链同时扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR 产物大小进行判读。该方法属于定性检测，操作简单成本低，但通量和准确性都较低。

综上所述，现有的技术都存在一定的缺陷，亟需一种快速、有效、易操作、成本低的提高长片段插入检测准确性的方法。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种染色体长片段插入的检测方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供上述检测方法在检测药物代谢中的应用。

本发明提供了一种染色体长片段插入的检测方法，所述检测方法包括：

通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型，通过第二检测单元鉴别待测样品是否为突变型，对第一检测单元的鉴别结果和第二检测单元的鉴别结果进行判读，判断待测样品是否有染色体长片段插入；