[发明专利]一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒。利用2对APOE特异性引物，分别扩增人类APOE基因112位点和158位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。本发明在保证检出特异性和灵敏度的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。

技术领域

本发明涉及一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒，属于基因多态性检测技术领域。

背景技术

人APOE基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q13.2)上，含有4个外显子和3个内含子。

APOE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三种杂合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六种常见表型。APOE3/3型又称野生型。APOE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。APOE4在这两个位置上都是Arg；E2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为APOE3异构体，自然人群中，基因频率ε3分布最高，APOE3/3表型分布约70％。见下表

APOE基因是阿尔兹海默症的一个重要的遗传危险因素。APOE 4等位基因与晚发性家族性AD和散发性AD相关，而APOE2等位基因则对此类疾病具有防护作用。每多遗传一个APOE4的等位基因，相应就增加45％的AD的患病危险,也使得其发病年龄提前。在晚发型家族性AD中,每个APOE4的等位基因能将发病年龄提前7-9年。

APOE基因分型是目前除了影像学外，更及时和有效的针对阿尔兹海默症的风险评估方法；对阿尔兹海默症后期发病预测有较高的准确性，特别是家族性受检者；还可以对APOE4基因型人群进行风险预警。

APOE的基因位点具有遗传多态性，多态性与个体血脂水平及动脉粥样硬化的发生发展密切相关。通过对APOE基因类型的检测，可以早期预测心脑血管疾病等的发病概率，反应个体血脂水平及动脉粥样硬化的发生发展，指导他汀类用药，并可以此实施健康管理，实现尽早预防。

发明内容

为了克服现有技术检测能力的不足，本发明利用2对载脂蛋白E(APOE)特异性引物，分别扩增人类APOE基因112位点和158位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针(5’末端标记FAM荧光素和5’末端标记VIC荧光素)，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

本发明设置了UNG酶+dUTP防污染措施，即PCR扩增利用UNG酶将可能存在的PCR产物污染充分降解。以排除由此可能引起的假阳性结果。

本发明以人类GAPDH基因作为内参基因设计特异性引物和探针(5’末端标记ROX荧光素)，实时检测系统的工作情况，以此排除假阴性结果。

本发明的基因多态性包括APOE基因112TT+158CC型(APOEε3/ε3型)、112TT+158TT型(APOEε2/ε2型)、112CC+158CC型(APOEε4/ε4型)、112T/C+158CC型(APOEε3/ε4型)、112TT+158T/C型(APOEε2/ε3型)、112T/C+158T/C型(APOEε2/ε4型)型基因多态性。

本发明的技术方案如下：