[发明专利]抗CD47纳米抗体突变体及其应用

说明书

本发明涉及抗体领域，特别涉及抗CD47纳米抗体突变体及其应用。本发明通过对原有纳米抗体序列进行突变，得到亲和力提高的抗CD47纳米抗体序列VHH2^mut，提高其应用价值。本发明得到的突变体纳米抗体序列VHH2^mut与原生序列相比亲和力提高了87.4倍，Tm值提高7.6℃。

技术领域

本发明涉及抗体领域，特别涉及抗CD47纳米抗体突变体及其应用。

背景技术

CD47(Cluster of Differentiation 47)也被称为整合素相关蛋白(integrinassociated protein，IAP)，分子量约为47～55kDa，是一种高度糖基化的跨膜蛋白。CD47可与膜整合素结合，也可与血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα结合，介导细胞双向信号传导进而调控免疫应答，是细胞表面至关重要的标记物。CD47参与一系列细胞过程，包括白细胞粘附和迁移、T细胞活化、细胞凋亡和吞噬作用。

CD47通过与吞噬细胞表面的SIRPα相互作用抑制细胞吞噬作用，向免疫系统中的巨噬细胞发出“不吃我”的信号；此信号可抑制后者对恶性肿瘤细胞介导的细胞毒性反应，从而导致免疫逃逸。这一现象有助于肿瘤的转移和演进，因此被认为是一种典型的肿瘤标志物，并在近几年成为某些癌症及肿瘤的潜在治疗靶点。抑制CD47信号可增强巨噬细胞的吞噬活性；在临床前模型中，可导致肿瘤生长受损，抑制转移扩散及肿瘤消退。

CD47参与调控多个信号通路，例如CD47/SIRPα信号通路、 MIAT/miR-149-5p/CD47信号通路、BRAF/MEK通路、SLAMF7/Mac-1通路及PD-1/PDL1通路。其中前者研究最为透彻，机理阐释最为清楚。 CD47/SIRPα相互作用形成双向信号传导，导致不同的细胞间反应，包括抑制吞噬、刺激细胞融合和T细胞激活，因此靶向封闭CD47/SIRPα信号通路被认为是激活巨噬细胞抗肿瘤活性的重要手段之一。

纳米抗体(Nb)因其晶体结构处于纳米级水平而得名，是天然存在的可结合抗原的最小片段。骆驼科动物体内存在天然缺失轻链和CH1 部分的重链抗体，克隆其可变区得到的抗体片段称为纳米抗体。相较于传统 IgG抗体，纳米抗体没有轻链及重链CH1区，只含有一个重链可变区构成的结构域。一般来说，其结构呈椭圆形，尺寸处于纳米级，分子质量仅为传统单抗的1/10(约12～15kDa)。基于其独特的空间结构，纳米抗体具有许多优异的特性，例如易于获得和表达、高稳定性、高水溶性、识别独特的抗原表位等，此外还有与人源IgG序列同源、亲和力高、易改造等优点。

纳米抗体首先发现于骆驼科动物体内，随后在鲨鱼、银鲛等软骨鱼中发现了类似的抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)，其中骆驼源纳米抗体应用最为广泛。骆驼源VHH结构包含4个骨架区(Frameworkregion,FR) 和3个高变区(Hypervariable region,HVR，即CDR区)。由于VHH的 CDR数量仅为传统抗体的一半，因此进化出了相对于VH更长的CDR1和 CDR3：人源VH的CDR3长度为9～12个氨基酸，驼源VHH的CDR3长度为13～18个氨基酸。更长的CDR1及CDR3保证了VHH结合抗原的有效性，甚至帮助其识别隐藏的特殊抗原结合位点。

此外，VHH与VH的FR2区也存在不同。IgG的FR2区含有4个疏水性氨基酸：V37、G44、L45和W47，这些残基参与和VL的相互作用；而在VHH的FR2区中这些位点被替换成了亲水性氨基酸：F/Y37， E/Q44，R/C45和G/F/S/L47。这一特性使得VHH的柔性变大，溶解度增强。除去FR1(Cys22)与FR3(Cys92)之间形成的二硫键外，CDR1(或 FR2)与CDR3也含有一对二硫键，进一步稳定CDR3的凸环结构。

由于利用常规展示技术筛选出的纳米抗体序列并未经过抗原驱动的体内亲和力成熟过程，故亲和力相对较低，限制了进一步开发及应用的可能性。因此有必要针对纳米抗体亲和力进行理性设计探索，以期弥补未经体内亲和力成熟的缺陷，提高其亲和力。