[发明专利]一种凝血酶抑制活性的测定方法

说明书

本发明公开了一种凝血酶抑制活性的测定方法，取纤维蛋白原溶液和待测试样溶液混合，加入含有磁珠的血凝杯中，作为检测组；使用等体积的缓冲液替代所述检测组中的待测试样溶液，作为空白组；将所述检测组和空白组分别置于37℃放置60～300s，加入步骤S1所述凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测血凝杯中溶液的凝固时间，使用t检验对凝固时间进行显著性分析，如果检测组的凝固时间显著大于空白组(P＜0.05)，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性。本发明对缓冲液的组分及检测手段进行了优化和改进，有效的避免现了有方法进行检测时出现假阳性结果；并且扩大了可检测样品的范围，为检测提供更大、更准确的样本空间。

技术领域

本发明涉及抗凝血技术领域，具体涉及一种凝血酶抑制活性的测定方法。

背景技术

由于现代人们工作压力大、生活节奏快，以及睡眠不足、过度饮食、嗜烟和酗酒等不良的生活习惯的影响，心脑血管疾病中的血栓性疾病现已成为人类的头号杀手。目前，心血管疾病在欧洲每年造成几百万人过早死亡，在我国心血管病患病率处于持续上升阶段。推算心血管疾病现患病人数2.9亿，并且今后10年心血管病患病人数仍将快速增长。据调查，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，农村为45.01％，城市为42.61％，且患病率随年龄升高而增加，我国每年有近350万人死于心血管疾病，占总死亡人数的41％以上。

目前血栓性疾病属于主要危害我国居民生活健康的心脑血管疾病之一。凝血酶作为人体内凝血过程中的关键酶，一直受到广泛研究。目前较为常见且高效的抗血栓药物，如：比伐卢定，阿加曲班，肝素等，都是直接或间接抑制凝血酶活性从而达到抗血栓的目的。然而，这些药物虽效果较好但是都存在一定的副作用，如血小板减少和引起出血等。认识到这些药物的缺点，寻找新的抗血栓药物迫在眉睫。在这种背景下，准确快速且便捷的凝血酶抑制剂活性检测方法就显得尤为重要

目前，已有且较为成熟的体外检测抗凝血酶抑制剂活性的方法有：发色底物法、凝血酶时间法(TT)、纤维蛋白原凝固时间法等。前者通过比较吸光度大小差异来表征凝血酶抑制剂活性，后两个则是通过比较凝固时间的不同来表征凝血酶抑制剂的活性。而目前较为常用且灵敏度较高的检测方法为发色底物法与凝血四项法。该方法能具有快速，简便，灵敏等优点。同时，该方法还可以准确判断抑制剂是否与凝血酶活性中心结合从而产生抑制效果。但此方法存在的问题是仅能准确表征与凝血酶活性中心相互结合的抑制剂，而对于与凝血酶其它位点结合的抑制剂表征效果不理想。而在2007年，由杨万根等人提出的通过检测纤维蛋白原凝块吸光度的变化判断抑制剂的活性。该方法虽然可以用来检测抑制剂是否与凝血酶外置位点结合，但仍存在一些缺陷。因此，需要一种新的凝血酶抑制剂的检测方法，来更完善更准确的对抑制剂活性进行表征。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有凝血酶抑制剂检测方法适应范围较窄，无法考虑到凝血酶外置位点，从而提供一种新的，适用范围更广的凝血酶抑制活性的测定方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种凝血酶抑制活性的测定方法，包括步骤：

S1、分别使用缓冲液溶解纤维蛋白原、凝血酶和待测试样，配置成纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液和待测试样溶液；所述纤维蛋白原溶液放置37℃备用，凝血酶溶液放置于4℃中备用；其中所述缓冲液为缓冲液A或缓冲液B；所述缓冲液A：咪唑浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1～0.15mol/L、氯化钙浓度为0.001～0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；所述缓冲液B：Tris浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1～0.15mol/L、氯化钙浓度为0.001～0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；