[发明专利]以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌

说明书

本发明公开了一种以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌。所述的基因工程菌为将红球菌中的粘糠酸环化异构酶、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因三基因敲除，并插入原儿茶酸脱羧酶基因和原儿茶酸脱羧酶辅酶基因的基因工程菌。本发明通过将微生物中粘糠酸降解途径敲除使菌株能够利用木质素生产粘糠酸，随后敲除粘糠酸前体物质—邻苯二酚的代谢支路途径使得更多的代谢流流向粘糠酸，并敲除菌株的原儿茶酸降解途径以阻断原儿茶酸的代谢途径，最后导入外源原儿茶酸脱羧酶基因和异戊二烯化辅因子酶基因连接原儿茶酸到邻苯二酚的代谢路径以扩大菌株的底物谱。本发明的基因工程菌可以利用木质素生产粘糠酸，实现木质素的高值化利用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌。

背景技术

木质纤维素类生物质，如农业秸秆、林业废弃物等属于可再生资源，是化石资源最可能的替代者。木质纤维素主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素和半纤维素通过预处理技术、酶水解技术、微生物发酵技术已经可以较为高效地转化为乙醇、油脂等产品(孙明荣,刘晓欣,谢文华,等.生物炼制经济的发展思路和展望[J].化工进展,2017,36(09):3250-3256.)。但由于木质素结构复杂、难以被降解利用的特点，至今为止还没有一种高效的木质素利用方式，其多是被焚烧用来供给热能，既造成了能源的极大浪费而且破坏了环境。

木质素主要由三种芳香物单体组成，分别是芥子醇(S型木质素单体)、松柏醇(G型木质素单体)、对香豆醇(H型木质素单体)。这三种木质素单体通过复杂的化学键(例如，β-O-4、β-5、β-β、5-5/β-O-4等)形成了木质素大分子结构。由于木质素自身结构的复杂性和稳定性，木质素的降解遇到较大的障碍。目前木质素可以使用热化学的方法进行降解，例如热解、氢解、化学氧化、超临界条件下水解等(Li C,Zhao X,Wang A,et al.Catalytictransformation of lignin for the production of chemicals and fuels[J].Chemical reviews,2015,115(21):11559-11624)。这些方法在很大程度上推动了木质素的转化利用，但是获得的木质素裂解液成分复杂并且单种类化合物浓度低，很多情况下并不适合进行单一化合物的分离和提取。除了木质素定向裂解的相关研究外，具有丰富的代谢途径的微生物可以将木质素及木质素形成的复杂芳香类混合产物通过代谢途径进行整合，最终形成一种或几种主要产物，实现木质素到相关产品的转化。

粘糠酸是一系列芳香族化合物降解过程中天然就存在的中间代谢产物，木质素及许多木质素衍生的芳香族化合物在降解过程中均以粘糠酸为代谢中间产物，例如硫酸盐木质素、碱木质素、苯甲酸、苯酚、邻苯二酚、香草醛、对-香豆酸、苯等(Bugg T D H,Ahmad M,Hardiman E M,et al.Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi[J].Natural product reports,2011,28(12):1883-1896；Eggeling L,SahmH.Degradation of coniferyl alcohol and other lignin-related aromaticcompounds by Nocardia sp.DSM 1069[J].Archives of Microbiology,1980,126(2):141-148)。同时粘糠酸也是一种重要的化工原料前体，可以用来合成尼龙-6,6等化学品。但由于在木质素的微生物降解过程中，生成的粘糠酸会快速被相关酶催化进行后续的反应，因此粘糠酸几乎不能进行累积。

发明内容

针对现有木质素高值化利用存在的问题，本发明提供一种以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌。

实现本发明目的的技术方案如下：