[发明专利]一种分离纯化β-葡萄糖苷酶融合蛋白的方法

说明书

本发明主要涉及一种分离纯化β‑葡萄糖苷酶融合蛋白的方法，属于分离纯化技术领域；本发明首先诱导表达融合蛋白GLEGB，然后将含有融合蛋白的菌液、表面活性剂和(NH4)₂SO₄混合作为下相，上相为PEG2000，进行浮选，分别收集浮选后的上下相溶液，记录体积，并测定浮选后上相和下相中的酶活和蛋白含量；在收集的上相混合液中添加硫酸铵，水浴加热，离心去上清；之后用Tris‑HCl缓冲液重悬沉淀，并在低温下孵育一定时间，离心去杂质，得到纯化的目标酶溶液；本发明通过ATPF与ITC相结合，对融合酶GLEGB进行两步纯化，大大提高了纯化效率，且整个操作简单，成本低，无污染。

技术领域

本发明主要涉及一种分离纯化β-葡萄糖苷酶融合蛋白的方法，特别涉及一种运用疏水性标签性能构建浮选体系，同时结合温敏性材料从而对融合β-葡萄糖苷酶进行分离纯化的方法；属于分离纯化技术领域。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-Glu)是一种能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键的水解酶，而且与萜烯类香气前驱体有密切关系，因此，在降解纤维素、改善食品风味等领域具有重要的应用价值。此外，它还参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能有重要作用。因此，对β-Glu的研究具有重要的理论和实用价值。

在纤维素的酶解过程中，β-葡萄糖苷酶可应用于乳品工业中分解乳糖，可以作为风味酶应用于(果)酒、茶叶、果汁中起到增香作用；在医学中β-葡萄糖苷酶活性的应用在某些病症的信息获取中也发挥着重要作用；日用化工业中，利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷作用，可以生产非离子表面活性剂烷基糖苷。因此，分离纯化β-葡萄糖苷酶(β-Glu)有着非常重要的现实意义。

目前常用的纯化β-葡萄糖苷酶(β-Glu)的方法主要有：硫酸铵/丙酮分级沉淀、DEAE 阴离子交换层析、凝胶过滤、葡聚糖凝胶柱层析、透析、高效液相色谱等方法。这些方法的缺陷在于单一的方法并不能完成β-葡萄糖苷酶(β-Glu)的分离纯化，需要多种方法结合使用，操作工艺复杂，提高了成本，且工作量较大，所需设备昂贵，而且产量较低，纯化倍数也很低，因而具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的在于克服目前分离纯化蛋白质方法中存在的提取工艺复杂，分离纯化效率低以及所选材料不能重复利用等缺陷，利用双水相浮选(ATPF)和逆转换循环(ITC)相结合，提供了一种新的分离纯化蛋白质的方法，该发明具有操作简便，分离效果好，酶活损失少等优点，不仅大大提高了最终的酶活回收率及纯化因子，还实现了上相中聚合物的分离，有效的解决了目前其他分离手段的限制，做到了上相的循环利用，节约了成本，保护了环境，有很大的现实意义。

为达到上述技术目的，本发明采取的技术手段如下：

(1)融合蛋白GLEGB的诱导表达

编码设计ELP氨基酸序列及GB多肽，用连接肽linker连接至葡萄糖苷酶(Glu)，构建重组质粒pET-GLEGB(这里的GLEGB为Glu-linker-ELP-GB的简写)；在大肠杆菌BL21细胞中进行重组质粒的诱导表达，首先在卡那霉素的存在下挑取目标转化体的单克隆菌过夜培养。之后按1％比例进行扩大培养。取出于冰上静置，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 诱导剂继续过夜培养。离心，收集菌体沉淀。用Tris-HCl缓冲液冲洗并重悬沉淀。加入苯甲基磺酰氟(PMSF)后于冰水浴中用超声破碎仪进行破碎。

(2)ATPF对融合蛋白GLEGB的分离纯化

将含有融合蛋白的菌液、表面活性剂和(NH₄)₂SO₄混合作为下相，上相为PEG2000，进行浮选，收集浮选后的上相酶液，准确记录体积，并测定浮选后的酶活性回收率和纯化因子。

其中：所述下相中硫酸铵的浓度为0.25g/mL-0.45g/mL；