[发明专利]提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法

说明书

本发明提出了一种提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法，属于基因工程领域。本发明通过从花生中克隆出分泌肽基因，构建植物基因表达载体后，利用发根农杆菌介导的方法获得含花生分泌肽基因的花生毛状根，并鉴定转基因花生毛状根中花生分泌肽基因的表达，测定花生毛状根的生物量，用Tricine SDS‑PAGE法测定花生分泌肽的表达水平，用BCA蛋白质定量检测法测定花生分泌肽的含量。本发明利用花生毛状根系统生产花生分泌肽具有操作简单、周期短、产量高、成本低且产物具有生物学活性等优点，是比较经济、高效的花生分泌肽制备方法。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法。

背景技术

花生是重要的油料作物，但其产量极易受到外界细菌、真菌、干旱或盐渍等环境胁迫的影响，已有研究表明，花生分泌肽在植物生长发育、抗菌、耐盐碱等方面发挥重要的作用，这为改良花生抗逆抗病性提供了新的研究方向。

目前，一般采用化学合成法和DNA重组合成法合成花生分泌肽，但化学合成法存在成本较高、副产物较多、产物没有生物学活性等缺点，DNA重组合成法由于不同的植物受体转化效率差异较大，造成最终产量参差不齐。现有技术中报道了利用毛状根培养体系得到转基因毛状根实现某些功能性物质的高产，但目前关于毛状根培养体系在花生分泌肽领域未见报道，所以如何培育出转基因花生毛状根，以提高有活性的花生分泌肽的含量，这对提高花生抵御环境胁迫的能力，实现花生增产具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术存在的技术问题，提出提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法，包括以下步骤：

从花生cDNA中克隆出花生分泌肽基因后，将所述花生分泌肽基因连接到表达载体上，构建含花生分泌肽基因的植物表达载体；

将含花生分泌肽基因的植物表达载体转化至发根农杆菌，获得含花生分泌肽基因的发根农杆菌；

利用含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染花生叶片，得到被含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染的花生叶片后，诱导其产生转基因花生毛状根，转入MS培养基中培养；

鉴定所述转基因花生毛状根中花生分泌肽基因是否表达后，测定转基因花生毛状根生产花生分泌肽的能力和含量。

在上述操作中，所述提取花生总RNA的方法为Trizol抽提法或根据RNA提取试剂盒说明提取得到；所述反转录过程是使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix反转录试剂盒说明制得的；利用含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染叶片前要对花生叶片进行预处理，即在叶片上加2-3处的划痕，目的是保证发根农杆菌菌液能进入叶片内完成诱导过程。

作为优选，构建所述植物表达载体的方法采用酶切连接法或gateway系统构建法。

作为优选，利用所述含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染花生叶片的方法是浸泡法或涂抹法。

作为优选，所述含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为0.5～3.0；所述转基因花生毛状根的培养时间为4周～8周。

在上述优选中，发根农杆菌菌液浓度OD₆₀₀可选择0.5、1.0、1.5、2.0或2.5等数值，转基因花生毛状根的培养时间可选取4周、6周或8周等。

作为优选，鉴定所述转基因花生毛状根中花生分泌肽基因表达的方法为RT-PCR法或qRT-PCR法。

作为优选，在测定所述转基因花生毛状根生产花生分泌肽的能力和含量之前，还包括测定转基因花生毛状根的生物量，步骤如下：