[发明专利]一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法

说明书

本发明公开一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，属于医疗领域用动物模型领域，包括以下步骤：S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×10⁹个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；S3、裸鼠胶质瘤模型建立：原位注射悬液于小鼠颅内，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型。本发明方法制备的人脑胶质瘤荧光裸鼠模型肿瘤生长和病理特性与人脑胶质瘤相似且可实时观察肿瘤生长，为人脑胶质瘤原位移植示踪研究胶质瘤及肿瘤微环境研究提供理想的研究模型。

技术领域

本发明属于医疗领域用动物模型领域，更具体的，涉及一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法。

背景技术

脑胶质瘤是来源于胶质细胞及其前身的原发肿瘤，是中枢神经系统最常见而又最难治疗的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的50％。由于大部分胶质瘤呈侵袭性生长，与周围正常脑组织界限不清，手术难以彻底切除肿瘤。基于胶质瘤细胞的生物多样性及发病机制尚未明确的情况，其至今仍是所有恶性肿瘤中接受综合治理预后最差的一类中枢神经系统肿瘤，胶质母细胞瘤患者的平均生存周期仅为14.6个月。如何提高脑胶质瘤的治疗效果已经成为神经外科最富挑战性的难题之一。

国内外科研工作者都在广泛开展脑胶质瘤的基础研究，其中动物模型作为研究领域的重要工具也最受广大研究者的青睐。转基因技术及细胞培养技术的发展大力推进了各种基于人类基因异常的大/小鼠胶质瘤模型及基于细胞建立的人脑胶质瘤模型，尤其是原位肿瘤模型的建立。虽然目前此类动物模型较为成熟，但存在一定的不足：

1)由于细胞系的易于培养，经济且高效，目前以细胞系如U251和9L建立的肿瘤模型较为常见，如中国专利号CN200610000881.2公开了一种稳定表达萤火虫荧光素酶的9L^LUC细胞株的构建与应用，但由于细胞系在体外持续传代，连续传代的细胞系适应了外界培养皿的环境，逐渐丧失了肿瘤的异质性且相关的信号通路等也发生改变，无法准确代表细胞在机体内部的生理变化。

2)基于近交系免疫缺陷小鼠建立的可稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的肿瘤模型虽然可以直观的分辨肿瘤于宿主之间的复杂关系，如中国专利号CN201710452157.1公开了一种建立绿色荧光BALB/c裸小鼠模型的方法及模型应用，但GFP有较强的背景干扰，其敏感性和精确度都大大降低，且培育合适小鼠的周期太长，花费较大、操作复杂。

发明内容

基于上述问题，本发明提供了一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠模型的方法。虽然原代细胞相较于细胞系，在体外极难获得与培养，但与胶质瘤细胞系不同，原代细胞分离自新鲜的临床组织，其很好的反应了肿瘤的异质性问题；通过体外质粒转染操作，将荧光素酶质粒转入到原代胶质瘤细胞，通过筛选获得稳定表达荧光素酶的稳转细胞后，再将含有质粒的原代细胞通过微量注射器精准注射到裸鼠脑部的安全部位，接种后7d通过动物活体成像仪观察肿瘤增长情况，操作上方便易行，便于观察肿瘤与宿主动物之间的关系，缩短实验周期，减少花费。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，包括以下步骤：

S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；

S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×10⁹个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；

S3、裸鼠胶质瘤模型建立：取步骤S2的悬液5-8μL缓慢注入小鼠颅内，定期监测裸鼠的后期反应，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型；