[发明专利]一种双光子比率型荧光探针在检测单胺氧化酶B中的应用

说明书

本发明公开了一种双光子比率型荧光探针精确测量肿瘤细胞中的单胺氧化酶B的制备方法和应用。该探针基于荧光共振能量转移机理，利用酶促氧化脱氨基反应产生相应的亚胺离子，经水解后消除，重新释放羟基，导致荧光发射信号比例性的变化。优势在于，能量供体与受体之间的荧光光谱距离更大，光谱之间的干扰更小，灵敏度更高，有效避免了各种环境条件对分析的干扰。为临床用于检测活体内阿尔兹海默症的重要标志酶提供了潜在工具。

技术领域

本发明涉及小分子荧光探针鉴定异常的生物酶活性在癌细胞中的位置和表达水平，更具体地说是一种基于荧光共振能量转移的双光子萘衍生物荧光探针对阿尔兹海默症的重要标志物单胺氧化酶B（MAO-B）的检测。

背景技术

阿尔兹海默症（AD）是老年人中最常见的痴呆症，目前影响全球超过3500万人。特别地，与其相关生物标志物的临床检测对于疾病的早期诊断，治疗和管理具有重要意义。单胺氧化酶B（MAO-B）是线粒体结合的黄素酶,在人脑中高度表达,主要存在于星形胶质细胞，其有助于维持大脑中神经递质的稳态，从而确保适当的神经和行为结果。目前，已经证明MAO-B的过度活化会导致产生过量的神经毒性副产物，如H₂O₂，从而引发以AD为典型代表的精神疾病和神经退行性疾病。因此，鉴定生物标志酶在神经细胞中的位置和表达水平成为早期病症的诊断和监测治疗的关键，也是当前该研究领域亟需解决的问题之一。

目前已经应用了几种成像技术来检测或成像酶，例如磁共振成像（MRI），核成像（包括单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET））以及荧光成像。每一种技术都是不可替代的，具有自己的特征灵敏度，穿透深度和空间分辨率。例如，MRI对活癌细胞中低丰度的酶缺乏足够的特异性和敏感性。SPECT和PET具有高灵敏度和断层扫描能力，但空间分辨率较差（1-2 mm）。其他一些检测方法，如使用标记抗体或蛋白质组学方法，可用于检测和跟踪固定细胞中的酶或在体外进行检测，但未能提供活细胞中酶的实时信息。为了克服这些缺点，基于小分子荧光探针的荧光成像技术已被广泛用于可视化和量化活细胞动态过程中，其具有灵敏度高，非破坏性快速分析和实时检测的优势。

大多数小分子酶荧光探针是基于探针与酶活性位点的特异性相互作用而设计的，包括催化位点和结合位点。酶具有区分各种底物之间微小差异和催化底物特异性反应的能力，通过将最佳底物基团连接到荧光团来产生基于底物的探针，荧光团在活性酶催化时其光谱性质相应改变。在基于FRET的探针中，荧光团和底物通过酶可水解的识别底物在一定距离内彼此连接，以产生比率型探针，其在底物通过特异性酶催化反应释放后恢复荧光。总之，理想的小分子酶探针在靶酶催化的化学修饰后应产生可检测的荧光变化，本文中，设计并合成了一种新的双光子高效比率型荧光化合物（FTP-B），用于检测生物系统中单胺氧化酶B（MAO-B）的活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题：一是提供一种原料廉价易得，合成步骤简单，反应条件温和的荧光探针合成方法。二是提供了一种具有大斯托克斯位移、检测速度快、选择性强、灵敏度高、低细胞毒性，用于检测生物样品、活细胞和动物中的MAO-B的新型比率双光子荧光探针。

为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下，一种特异性识别MAO-B的比率双光子荧光探针，具有如下分子结构式：

上述单胺氧化酶B荧光探针的制备方法如下：

1）将1 eq的Np-Rhod染料与2.5 eq碳酸钾，溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，然后向混合液中加入3 eq的1，3-二溴丙烷，室温下搅拌4 h后升温至60℃回流12 h。用TCL板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸发，并用硅胶柱进行分离，得到化合物FTP-B1，其结构式如下：