[发明专利]一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制备方法，属于抗体制备技术领域。从口蹄疫病毒抗原免疫猪体内分离PBMCs，使用染料标记FMDV 146S抗原，对PBMCs进行染色，借助多色流式细胞仪分选结合FMDV的单个B细胞；结合单细胞抗体基因测序，分别获得VH和VL基因，通过柔性linker及CHO‑S表达工程抗体技术，表达获得FMDV特异性猪源单链基因工程抗体。本发明所述制备方法获得的抗体具有基因多样性好，效率高，全宿主(猪)来源，需要细胞量少等优势。

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种抗口蹄疫病毒猪源单链基 因工程抗体的制备方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是严重危害猪、牛与羊的重大 动物疫病。口蹄疫病毒(FMDV)有七个血清型，分别为O型、A型、Asia 1型、C型、SAT1～3型，各个血清型间无交叉免疫反应。我国主要流行O 型FMDV和A型FMDV。FMDV每个血清型又根据流行的区域划分为多个 拓扑型(VP1，85％氨基酸同源性)。我国目前存在3个谱系的O型FMDV， 分别为O/Mya/98(东南亚拓扑型)，O/PanAsia(中东南亚拓扑型)和O/Cathay (中国拓扑型)，三个谱系病毒的抗原结构存在较大差异，交叉免疫保护效 果较弱，不能对异源毒株提供很好的交叉免疫保护。A型FMDV在我国主 要存在SEA97拓扑型，其中包括G1和G2分支。可以看出FMDV在我国流 行相当复杂，抗原变异较大。因此，研究FMDV抗原结构对疫苗毒株设计 具有重要意义。单克隆抗体无疑是解析抗原结构的重要工具。

单克隆抗体来源于B细胞，抗体胚系基因VDJ片段通过基因重排和体 细胞突变，产生特异性单个B细胞克隆，B细胞进一步分化成浆细胞，最终 分泌产生特异性单克隆抗体。可以看出抗体胚系基因VDJ重排决定了抗体 的多样性，然而不同物种在VDJ基因片段数量上存在很大差异。据报道， 小鼠重链IGH基因含有101个V基因片段，9个D基因片段，4个J基因片 段。猪重链IGH基因约有20个功能性V基因片段，2个D基因片段和1 个J基因片段。轻链分为K轻链和L轻链，具有稳定抗体分子构象的角色， 小鼠抗体K:L轻链比例为95％：5％，而猪抗体K:L轻链比例为50％：50％。 综上可以看出，不同物种间VDJ基因组成差异以及CDR3长度差异，以及 K/L轻链组成比例差异，所引起的抗体多样性，势必可能导致宿主特异性抗原位点的产生。对FMDV抗原结构研究发现，最初通过合成肽段和免疫接 种试验结果分析，认为VP1蛋白上G-H环和C末端形成的抗原位点1是免 疫优势性抗原位点。然而，使用抗原位点1制备的合成肽疫苗免疫牛后并不 能提供完全的免疫力。在猪上，比较研究免疫血清对单抗逃逸毒株和免疫毒 株之间的中和滴度差异，认为O型FMDV抗原位点2对猪是免疫优势性抗 原位点。然而，使用含有多个谱系FMDV的VP1蛋白G-H环和C末端基因 融合表达的O型或A型FDMV多表位疫苗，免疫猪后均提供了完全的保护 力。这些研究结果说明，FMDV存在宿主特异性抗原位点，利用自然宿主来 源单抗鉴定其识别抗原位点对解析FMDV抗原结构和疫苗设计具有重要指 导意义。目前，用于研究FMDV抗原结构的单克隆抗体主要是鼠源性单克 隆抗体。然而由于猪是FMDV的自然感染宿主，且鼠与猪的B细胞多样性 存在较大差异，因此产生FMDV特异性猪源单克隆抗体对解析FMDV抗原 结构，尤其是发现FMDV宿主特异性抗原位点具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制 备方法。本发明所述制备方法获得的抗体具有基因多样性好，效率高，全宿 主(猪)来源，需要细胞量少等优势。

本发明提供了一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制备方法抗 体的制备方法，包括以下步骤：

1)从免疫口蹄疫病毒抗原的猪血液样本中分离外周血单个核细胞；