[发明专利]一种大豆灰斑病离体叶片鉴定方法

说明书

本发明公开了一种大豆灰斑病离体叶片鉴定方法，涉及遗传育种技术领域，克服田间鉴定易受时间、空间等环境因素的干扰影响；克服田间鉴定结果准确性低、重复性较差的问题。本发明提供的方法为：取待测品种大豆叶片预处理；将预处理后的大豆叶片置于保持叶片正常存活的环境下；用高压水枪对所得叶片进行蒸馏水喷打压力处理；用高压喷雾器将灰斑病原菌孢子悬浮液均匀喷洒到所得叶片表面进行接种；所得叶片培养14天后统计叶片发病情况，从而判定待测品种的抗病性。该方法具有环境可控、鉴定准确、显症时间更短，显症效果更好等特点，可用于大豆抗灰斑病种质资源筛选，选育抗源为抗病育种提供优异亲本。

技术领域

本申请涉及遗传育种技术领域，具体涉及一种大豆灰斑病离体叶片鉴定方法。

背景技术

大豆灰斑病是一种危害严重，发生范围广的世界性大豆真菌病害，严重威胁大豆的生产。在我国，尤以东北三省发生最为严重，严重发生年份可使大豆减产30％左右。目前，防治大豆灰斑病最经济、安全有效的方法是选育并利用抗病品种，因此，高效准确鉴定抗病种质的方法对于选育抗病品种具有重要意义。目前大豆灰斑病的鉴定方法包括田间孢子喷雾法、室内大豆灰斑病菌毒素法和菌丝块离体叶接种鉴定法，三种鉴定大豆灰斑病的方法各有优缺点，受到每种方法的技术手段、成本及操作难度的限制难以在实验室内小范围多重复简单准确的进行接种鉴定实验，尤其在被测品种样本容量大的情况下，如进行较准确重复性较好的大规模种质资源抗灰斑病鉴定的难度很大。

目前大豆灰斑病的鉴定方法包括田间孢子喷雾法、室内大豆灰斑病菌毒素法和菌丝块离体叶接种鉴定法，以上鉴定方法均存在明显的不足之处，难于在实验室中广泛应用，其中田间孢子喷雾法易受时间和空间限制、鉴定结果重复性差、准确性低且易对植株造成毁灭性伤害；室内大豆灰斑病菌毒素法的鉴定结果同大田鉴定结果的基本符合率较低(62.37％)；菌丝块离体叶接种鉴定法的发病率较差，对鉴定环境要求高。

发明内容

本发明提供一种基于高压水枪处理的大豆灰斑病离体叶片鉴定方法，该方法克服田间鉴定易受时间、空间等环境因素的干扰影响；克服田间鉴定喷雾处理叶片不均匀引起的鉴定结果准确性低；克服田间鉴定重复性较差的问题。

本发明提供的大豆灰斑病离体叶片鉴定方法，按照以下技术方案实现：

(1)取待测品种大豆叶片预处理；

(2)将预处理后的大豆叶片置于保持叶片正常存活的环境下；

(3)用高压水枪对步骤(2)所得叶片进行蒸馏水喷打压力处理；

(4)用高压喷雾器将灰斑病原菌孢子悬浮液均匀喷洒到步骤(3)所得叶片表面进行接种；

(5)步骤(4)所得叶片培养14天后统计叶片发病情况，从而判定待测品种的抗病性。

步骤(1)所述大豆叶片预处理，具体为：选取同一位节生长势相近的新鲜大豆完全展开叶，将带柄三出复叶剪下后再将三出复叶的三片小叶分别剪下，用无菌水冲洗干净。

步骤(2)所述保持叶片正常存活的环境，制备方法为：在容器底部铺设纱布，纱布上铺设厚度为8.32-9.71mm且厚度均匀的脱脂棉层，脱脂棉层上铺设表层纱布，向容器内加入蒸馏水，浸润纱布及脱脂棉，加水量以达到纱布和脱脂棉的最大持水量为准。

步骤(1)预处理后的叶片，按品种号有序地将叶片正面朝上摆放在步骤(2)所述保持叶片正常存活的环境的表层纱布表面，叶柄与表层纱布紧密接触，叶片之间水平/垂直距离为5-7cm。

步骤(3)所述高压水枪处理，具体为：使高压水枪的出水方向垂直于叶片表面，边向叶片表面喷水边移动，移动方式为：对同一叶片，横向移动完成全部叶片表面的喷水处理后，再纵向移动完成全部叶片表面的喷水处理，最后以螺旋方式移动，完成全部叶片表面的喷水处理。

步骤(3)所述高压水枪处理，高压水枪额定排气压力为0.7Mpa。