[发明专利]一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针及其应用

说明书

本发明公开了一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针，第一组探针的左侧探针LPO具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，用于检测三线镰刀菌；第二组探针的左侧探针LPO具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，用于检测黄曲霉菌；第三组探针的左侧探针LPO具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，用于检测赭曲霉菌。本发明能在很短的时间内同时对中药材三种优势产毒真菌进行检测，该方法具有特异性好，检测灵敏度高等优点。

技术领域

本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种同时检测中药材黄曲霉、三线镰刀菌、赭曲霉三种毒源真菌污染的MLPA探针，本发明还涉及一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA方法和试剂盒。

背景技术

中药因其具有独特的疗效与作用，在保健、防治疾病、康复等方面发挥出了独特的优势，现已成为国际医药市场不可缺少的部分，受到了全世界消费者的关注。但是中药材及饮片生产模式粗放，全产业链问题繁多，在加工储藏环节尤为突出，导致产毒真菌滋生，部分中药材真菌污染率甚至高达95％。真菌分泌的酶能使药材化学成分降解导致药效降低，同时更重要的是它们产生的真菌毒素给服用者带来中毒危险，如曲霉属真菌产生的黄曲霉毒素是迄今为止最毒化合物之一，其毒性是奶油黄的900倍，砒霜的68倍，被划定为一类致癌物。通过对大量中药材抽查发现除了曲霉属真菌污染高检出外，部分药材镰刀菌属真菌污染率甚至高达97.6％。因此，中药产生的黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素(主要由三线镰刀菌产生)、呕吐毒素等已是影响中药质量与使用安全的重要问题，快速检测其毒源真菌是对中药材真菌毒素污染进行及时监控和防治的关键。

然而由于毒素合成能力差异，并非同种所有菌株都能产生毒素，如曲霉属大部分真菌并不产毒，甚至常被用于传统食品加工。黄曲霉菌作为黄曲霉毒素主产菌，也仅10％的菌株可产毒素，且从形态上目前仍无法区分产毒株与非产毒株，给中药材毒源真菌污染及时防控造成很大技术瓶颈。随着真菌毒素合成基因的发现，从基因水平解释了产毒差异的根源，可利用分子生物学方法对合成途径关键基因进行检测并有效辨别产毒真菌。

多重连接依赖式探针扩增技术(Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification,简称MLPA)是一种新型的高通量体外核酸检测技术，该技术包括杂交-连接-扩增三个步骤，其中杂交和连接步骤保证了检测的特异性，扩增步骤使用通用引物进行PCR扩增，保证不同目标产物在扩增时效率一致，有效解决了多重PCR中扩增效率不一致和容易出现交叉反应的缺点，是一种方便、准确、廉价的多重核酸检测技术，在现场即时检测领域得到广泛关注。目前还没有采用MLPA方法对中药材多种毒源真菌进行检测的报导。

发明内容

本发明针对中药材三种优势产毒真菌黄曲霉菌、赭曲霉菌及三线镰刀菌，采用MLPA检测技术对其真菌毒素合成途径关键基因进行检测，从而建立一种同时检测中药材中三种毒源真菌污染的MLPA探针及其即时检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针，所述探针共有三组，每组探针分别由左侧探针LPO和右侧探针RPO组成，其中，

第一组探针的左侧探针LPO具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，用于检测三线镰刀菌；

第二组探针的左侧探针LPO具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，用于检测黄曲霉菌；

第三组探针的左侧探针LPO具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，用于检测赭曲霉菌。