[发明专利]苯丙酮酸脱羧酶突变体M538A在生物发酵生产苯乙醇中的应用

说明书

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，公开了苯丙酮酸脱羧酶突变体M538A在生物发酵生产苯乙醇中的应用。本发明通过定点突变的方式，将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.Lactis,其保藏号为CICC6246)的苯丙酮酸脱羧酶KivD分子催化结构域附近的第538位甲硫氨酸突变为丙氨酸显著提高了苯丙酮酸脱羧酶的酶活力，解决了目前苯丙酮酸脱羧酶对苯丙酮酸催化效率不高的问题，使用于苯乙醇的生物发酵，为苯乙醇的生产提供新思路，适合大规模推广。

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及苯丙酮酸脱羧酶突变体M538A在生物发酵生产苯乙醇中的应用。

背景技术

苯乙醇是一种具有淡雅、细腻而持久玫瑰花香气的芳香醇。因其具有的特殊气味，苯乙醇作为香料物质被广泛应用于香水、化妆品以及食品工业。苯乙醇还可以作为杀虫剂和新型生物燃料。因此，苯乙醇具有广泛的应用前景。

微生物主要将简单的碳源通过丙酮酮酸途径和Ehrlich途径代谢产生苯乙醇。然而只有少数微生物具有Ehrlich途径，因此利用微生物合成苯乙醇因菌种种类太少而受到极大限制。酮酸脱羧酶(EC4.1.1.43)是苯乙醇合成途径中关键酶，复杂催化苯丙酮酸生成苯丙醛，随后通过氧化还原反应进一步生成终产物苯乙醇。由于其底物作用的高度特异性，苯丙酮酸脱羧酶是苯乙醇生物合成的限速酶。目前，已经有研究主要通过筛选和优化表达酮酸脱羧酶提高其表达量。目前来自酿酒酵母酮酸脱羧酶Aro10，毕赤酵母中的酮酸脱羧酶Kdc,肠杆菌酮酸脱羧酶Kdc4427，固氮螺菌酮酸脱羧酶AbPDC和运动发酵单胞菌脱羧酶PDC和乳酸乳球菌中酮酸脱羧酶KivD被测试用于苯乙醇的合成，其中来自酵母菌种的酮酸脱羧酶Aro10是最优的酶。在大肠杆菌和酿酒酵母菌中被广泛应用于苯乙醇的合成。但是，这些菌株表达Aro10仍然存在底物特异性不高产生其他副产物和催化效率低等问题，因此，上述技术均并不能够真正运用于工业生产。

来源于乳酸乳球菌中酮酸脱羧酶KivD，是一类具有宽泛底物谱的酮酸脱羧酶，能够同时催化支链酮酸(3-甲基-2-氧代丁酸，4-甲基-2-氧代戊酸和3-甲基-2-氧代戊酸)，芳香族酮酸(4羟基苯丙酮酸，苯丙酮酸和苯甲酰甲酸)，和直链酮酸(2-氧代己酸，2-氧代戊酸和丙酮酸)。通过酶学性质分析发现，KivD最适合底物为支链酮酸中的3-甲基-2-氧代丁酸，用于生成异丁醇。乳酸乳球菌的KivD蛋白结构已被解析，研究人员发现在催化活性中心附近的461位缬氨酸，268位的丝氨酸，381位的苯丙氨酸，538位的甲硫氨酸和542位的苯丙氨酸对底物催化发挥重要的作用。为了获得相应的产物，这5个位点氨酸酸成为蛋白改造的关键靶标。研究人员Peter Lindblad等为了提高异丁醇的产量，提高KivD对3-甲基-2-氧代丁酸催化活性，对其中的四个位点进行了系列突变，构建了V461I(VI)，V461L(VL)，V461F(VF)，V461A(VA)，M538W(MW)，S286T(ST)，S286Y(SY)，S286A(SA)，F542L(FL)和F542W(FW)突变体。众多突变体中只有ST和VI的异丁醇产量大幅提高，提高了对3-甲基-2-氧代丁酸催化活性。James C.Liao课题组为提高3-甲基-1-戊醇的合成，对KivD进行双位点的叠加突变，构建四株突变菌种，分别为V461A/M538A，V461A/M538L，V461A/F381A和V461A/F381L，这四个突变体中3-甲基-1-戊醇产量比对照菌株提高了20-50倍，其中V461A/F381L中3-甲基-1-戊醇产量最高，达到384.3±30.3mg/L。由于对苯丙酮酸低的底物亲和力和催化效率，KivD几乎不被用于苯乙醇的合成。

发明内容

本发明的目的在于提供了苯丙酮酸脱羧酶突变体M538A在生物发酵生产苯乙醇中的应用，所述的苯丙酮酸脱羧酶突变体M538A的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：